鄭禮平，陳藝丹，張 楠，全 文，梁翠微，龔五星

(珠海市人民醫(yī)院， 暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院腫瘤科， 廣東 珠海 519000)

肺癌目前是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率都占惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅人民健康[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)占肺癌總數(shù)的85%左右，而大部分患者確診時(shí)已是晚期，無法行根治性手術(shù)切除。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)，如吉非替尼和厄洛替尼等，因?yàn)橛携熜Т_切、不良反應(yīng)輕微、口服給藥方便等優(yōu)點(diǎn)，已成為晚期NSCLC極其重要的治療手段,但在10～11個(gè)月的無進(jìn)展生存后，患者會(huì)對EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥[2-3]。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一組進(jìn)化保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，能在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控基因的表達(dá)。大量研究已證實(shí)，miRNA在腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的過程中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。miR-221參與了腫瘤的發(fā)生，我們前期研究也證實(shí)miR-221能夠促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞增殖[6]。但miR-221是否會(huì)影響NSCLC 對EGFR-TKI的耐藥，目前還沒有報(bào)道。因此本研究將miR-221抑制物轉(zhuǎn)染至吉非替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR中，觀察其對細(xì)胞耐藥性的影響，并探討具體的作用機(jī)制，為肺癌新的治療方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

人肺腺癌細(xì)胞PC9/GR(吉非替尼耐藥細(xì)胞) 和PC9 (吉非替尼敏感細(xì)胞)由本實(shí)驗(yàn)室保存。吉非替尼(gefitinib, 商品名：易瑞沙)購自AstraZeneca；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；抗人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten, PTEN)抗體購自Abcam； miR-221 inhibitor和miR-NC購自上海吉瑪制藥；CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；RNA提取試劑TRIzol和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔、抗鼠II抗均購自武漢博士德公司；雙螢光素酶檢測試劑盒購自Promega。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 肺癌PC9/GR細(xì)胞和PC9細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37 ℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞生長至約90%融合時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液后進(jìn)行離心，后使用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，制成5×108/L的懸液。將PC9/GR細(xì)胞轉(zhuǎn)種在6孔板中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在細(xì)胞融合80%～90%時(shí)轉(zhuǎn)染,在轉(zhuǎn)染前2 h更換成未含血清的新鮮培養(yǎng)基,將細(xì)胞分為：實(shí)驗(yàn)(miR-221 inhibitor)組，轉(zhuǎn)染miR-221 inhibitor；對照(control)組，轉(zhuǎn)染miR-NC；空白(blank)組，單用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染過程按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染24～48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

2.2RT-qPCR檢測細(xì)胞中miR-221的表達(dá) 收集細(xì)胞，采用TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，后用紫外分光光度計(jì)來檢測RNA的濃度和純度，控制A260/A280于1.8～2.0之間。依照RT-qPCR試劑盒提供的操作說明合成cDNA。擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置為:95 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃變性5 s、55 ℃延伸20 s、最后72 ℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)。U6為內(nèi)參照。標(biāo)本重復(fù)檢測3次，使用2-ΔΔCt法來分析計(jì)算。miR-221的上游引物序列為5’-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3’，下游引物序列為5’-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.3CCK-8法檢測肺癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性 將各組細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔1 000個(gè)細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的吉非替尼,設(shè)置7個(gè)呈2倍遞增梯度的濃度(1～64 μmol/L)，對照孔則不加藥物,每個(gè)藥物濃度設(shè)平行重復(fù)6孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，往每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續(xù)孵育2 h。然后在酶標(biāo)儀上采用450 nm波長測量各孔的吸光度(A)。重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)3次。計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率(%)=實(shí)驗(yàn)孔A值/對照孔A值×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算出吉非替尼的半數(shù)抑制濃度(the half-maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4Western blot檢測PTEN蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白質(zhì)樣品,用BCA法測定總蛋白濃度。取樣品蛋白50 μg，然后用SDS-PAGE進(jìn)行分離，后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加抗PTEN抗體及GAPDH抗體，4 ℃搖床孵育過夜;次日在室溫下用TBST液漂洗3次；同樣方法稀釋 II 抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，最后用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光、顯影及分析。

2.5雙螢光素酶報(bào)告基因檢測 首先合成PTEN 3’-UTR序列片段以及突變的3’-UTR序列片段，其中PTEN 3’-UTR序列片段能和miR-221相應(yīng)序列互補(bǔ)結(jié)合,然后克隆這2個(gè)片段到pGL3-Luciferase基因下游多克隆位點(diǎn)上。肺癌PC9/GR細(xì)胞按4×108/L接種在6孔板中。用LipofectamineTM2000將螢光素酶報(bào)告載體與miR-221 inhibitor及miR-NC進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，根據(jù)Promega公司雙螢光素酶報(bào)告基因進(jìn)行相應(yīng)檢測。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-221在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，PC9/GR細(xì)胞中的miR-221表達(dá)量明顯高于PC9細(xì)胞(P<0.01)，見圖1。轉(zhuǎn)染miR-221 inhibitor能夠顯著降低PC9/GR細(xì)胞中miR-221的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組miR-221表達(dá)量較對照組明顯減少(P<0.01)；對照組和空白組間miR-221含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 1.The expression levels of miR-221 in the lung cancer PC9 cells and PC9/GR cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPC9 cells.

圖1肺癌PC9細(xì)胞和PC9/GR細(xì)胞中miR-221的表達(dá)

Figure 2.The expression level of miR-221 in the PC9/GR cells transfected with miR-221 inhibitor. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖2肺癌PC9/GR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-221inhibitor后miR-221的表達(dá)

2 PC9/GR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-221 inhibitor后對吉非替尼耐藥性的變化

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率低于對照組(P<0.05)，見圖3。吉非替尼對實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組細(xì)胞的IC50分別是(4.65±0.48)μmol/L、(15.78±0.78)μmol/L和(14.54±0.85)μmol/L,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性明顯低于對照組(P<0.01)，見圖4。

Figure 3.The viability of PC9/GR cells treated with gefitinib for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3吉非替尼處理48h后PC9/GR細(xì)胞的存活率

Figure 4.The IC50of gefitinib for PC9/GR cells after gefitinib treatment for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖4吉非替尼處理48h后PC9/GR的IC50

3 Western blot檢測PTEN蛋白的表達(dá)

與PC9細(xì)胞相比，PC9/GR細(xì)胞中的PTEN蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，見圖5。轉(zhuǎn)染miR-221 inhibitor能夠顯著增加PC9/GR細(xì)胞中PETN的表達(dá), Western blot顯示實(shí)驗(yàn)組的PTEN蛋白水平較對照組和空白組升高(P<0.05)，見圖6。

4 PTEN是miR-221的下游靶基因

通過生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測miR-221的靶基因，提示PTEN可能是其下游作用基因。雙螢光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，含野生型PTEN的 3’-UTR序列細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-221 inhibitor后螢光素酶活性較對照組和空白組明顯增強(qiáng)(P<0.05)；而含突變型PTEN的3’-UTR序列細(xì)胞中，3組的螢光素酶活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖 7。

Figure 5.The relative protein expression of PTEN in the lung cancer PC9 cells and PC9/GR cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsPC9 cells.

圖5肺癌PC9和PC9/GR細(xì)胞中PTEN的表達(dá)

Figure 6.The relative protein expression of PTEN in the lung cancer PC9/GR cells transfected with miR-221 inhibitor. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖6轉(zhuǎn)染miR-221inhibitor后PC9/GR細(xì)胞的PTEN表達(dá)

Figure 7.The role of miR-221 in the targeting sequence of PTEN evaluated by detecting the activity of luciferase. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖7螢光素酶活性檢測miR-221對PTEN靶序列的作用

討 論

我國以及亞裔人群肺腺癌患者的EGFR基因敏感突變陽性率可高達(dá)40%～50%左右[7]。國內(nèi)外多個(gè)已發(fā)表的研究證實(shí)EGFR-TKI藥物極大地改善和延長攜帶這些驅(qū)動(dòng)基因的NSCLC患者的預(yù)后以及生存[8-9],但患者最終會(huì)出現(xiàn)TKI耐藥，導(dǎo)致疾病進(jìn)展，這無疑限制了TKI藥物的進(jìn)一步發(fā)展。獲得性耐藥的部分機(jī)制已清楚，包括EGFR激酶第二位點(diǎn)突變(T790M突變等)、組織轉(zhuǎn)化(上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、小細(xì)胞轉(zhuǎn)化)等，但還有很多的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

miRNA是一類長約19～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，其廣泛存在于真核生物體內(nèi)。miRNA通過與靶基因信使RNA特異性結(jié)合進(jìn)而誘導(dǎo)其降解或抑制其翻譯，引起靶蛋白的表達(dá)水平發(fā)生變化，從而調(diào)控下游的信號(hào)通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥等方面發(fā)揮了重要作用[4-5, 10]。miR-221定位于X染色體P11.3區(qū)約1 kb的區(qū)域內(nèi)，屬于成簇分布的miRNA。miR-221 在前列腺癌、結(jié)直腸癌和肝癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，扮演了“癌基因”的角色[11-13]。最近許多研究發(fā)現(xiàn)miR-221能影響腫瘤對抗癌藥物的耐藥性。在腦膠質(zhì)瘤中，miR-221通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路增強(qiáng)了癌細(xì)胞對卡莫司汀的耐藥性[14]。在乳腺癌MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221后，會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對氟維司群的耐藥程度[15]。

本課題組前期研究證實(shí)，miR-221在肺癌組織中高表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-221 mimics后能促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞增殖[6]。RT-qPCR結(jié)果顯示，PC9/GR細(xì)胞中的miR-221表達(dá)量是PC9細(xì)胞的7.15倍，說明miR-221對肺癌細(xì)胞吉非替尼耐藥可能起到重要作用。在PC9/GR細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221 inhibitor能降低肺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥程度。通過使用TargetScan靶基因預(yù)測軟件及結(jié)合發(fā)表的文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)PTEN可能是miR-221的直接靶標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)在人腦膠質(zhì)瘤中PTEN表達(dá)的下降會(huì)增強(qiáng)癌細(xì)胞對卡莫司汀的耐藥性[16]。Kim等[17]對129例胃癌患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)使用曲妥珠治療4個(gè)月內(nèi)就出現(xiàn)進(jìn)展的患者，其PTEN的表達(dá)水平較那些療效很好的患者明顯減少，多變量分析證實(shí)PTEN表達(dá)缺失是曲妥珠耐藥的獨(dú)立預(yù)測因子。本研究發(fā)現(xiàn)PC9/GR細(xì)胞中PTEN表達(dá)較PC9明顯減少；抑制PC9/GR細(xì)胞中miR-221表達(dá)后PTEN的表達(dá)會(huì)顯著升高；而且雙螢光素酶報(bào)告基因進(jìn)一步確定了PTEN為miR-221的下游靶基因。

綜上所述，miR-221可能通過靶基因PTEN來調(diào)控肺腺癌PC9/GR細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性，有望為肺癌的治療提供可能的作用靶點(diǎn)。