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瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A多態(tài)性與2型糖尿病腎病的關(guān)系

2019-03-21 02:35穆立煥王穎佟俊旺金秀平陳茜徐謙楊麗婉江蘭
中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2019年6期
關(guān)鍵詞:瘦素等位基因多態(tài)性

穆立煥,王穎,佟俊旺,金秀平,陳茜,徐謙,楊麗婉,江蘭

(1.華北理工大學,河北 唐山 063210;2.華北理工大學附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科,河北 唐山063000;3.華北理工大學 公共衛(wèi)生學院,河北 唐山 063210)

國際糖尿病聯(lián)盟2017年數(shù)據(jù)表明,全球4.25億成年人患糖尿病,2.12億未被確診,預計2045年將達6.29億[1]。糖尿病腎病是多基因參與的遺傳性疾病[2-3]。高血壓、高血脂、高血糖參與糖尿病腎病的發(fā)病。近年來多項研究表明,G-2548A多態(tài)性與大血管病變有關(guān),但對微血管病變研究甚少,糖尿病腎病屬于微血管病變,或許與大血管病變有相同的發(fā)病機制。本研究應用分子生物學技術(shù)對G-2548A多態(tài)性進行研究,旨在探討該位點多態(tài)性與糖尿病腎病的關(guān)系,為疾病的早期診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年5月—2017年5月在華北理工大學附屬醫(yī)院內(nèi)分泌病區(qū)住院的2型糖尿病腎病和無糖尿病腎病的2型糖尿病患者416例,均無血緣關(guān)系?;颊叱R?guī)降血糖、降血脂、降血壓治療不變。納入標準:符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標準[3];排除標準:合并糖尿病酮癥等急性并發(fā)癥、泌尿系感染、其他腎臟相關(guān)疾病、心功能不全、惡性腫瘤、妊娠、哺乳期及資料不完整等。通過測定尿微量白蛋白將患者分為兩組:無糖尿病腎病組男性102例,女性122例,平均年齡(56.2±11.1)歲;2型糖尿病腎病組男性96例,女性96例,平均年齡(58.3±11.5)歲。兩組患者年齡、性別方面比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)華北理工大學倫理委員會批準(批準號:2016113),所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測指標 測量身高、體重并計算體重指數(shù)(BMI),測量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)。采用乳膠凝集反應法測定糖化血紅蛋白(HbA1C)(寧波瑞源生物科技有限公司)。應用Olympus AU5400全自動生化分析儀(日本Olympus公司)測定相關(guān)血清指標:尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白A、載脂蛋白B。應用酶聯(lián)免疫法瘦素試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)測定血清瘦素。

1.2.2 分析瘦素基因多態(tài)性 抽取空腹靜脈血3 ml,應用北京莊盟國際生物基因科技有限公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA,PCR擴增DNA。查找Genebank中瘦素基因組序列,根據(jù)文獻[4]并使用引物設計軟件Premier 5.0優(yōu)化設計rs7799039位點所在序列引物?;驍U增引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。正向引物:5'GGATGGAGGCCCTAGTGGAA3',反向引物:5'GAGATTAAAGCAAAGACAGGCA3'。瘦素基因擴增體系:PCR Taq Master Mix 12.5μl,正反向引物各1.0μl,DNA模板1.0μl,雙蒸水25μl。PCR反應條件:94℃預變性5 min,94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸40 s,共35個循環(huán),72℃繼續(xù)延伸5 min。取PCR產(chǎn)物加樣于瓊脂糖凝膠孔中進行電泳,在紫外透視儀(安慶昌嘉電子產(chǎn)品貿(mào)易有限公司)下觀察結(jié)果并拍照。最后進行酶切(內(nèi)切酶HhaI由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司提供),在紫外透視儀下根據(jù)條帶位置和數(shù)目確定基因型,使用凝膠成像系統(tǒng)照相并保存。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較用t檢驗;非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距M(P25,P75)表示,比較用秩和檢驗;計數(shù)資料以構(gòu)成比(%)表示,比較用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床資料比較

2型糖尿病腎病組與無糖尿病腎病組患者瘦素、HbA1C、BUN、SCr、收縮壓、舒張壓比較,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),2型糖尿病腎病組患者瘦素、HbA1C、BUN、SCr、收縮壓、舒張壓高于無糖尿病腎病組。兩組患者UA、TG、TC、HDL-C、LDL-C、載脂蛋白A、載脂蛋白B比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、2。

表1 兩組患者臨床資料比較

表2 兩組患者血壓比較 (mmHg,x±s)

2.2 遺傳平衡檢驗結(jié)果

將所有研究對象進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗,AA、AG、GG基因型頻率分別為68.0%、30.3%和1.7%,A等位基因頻率為83.2%,G等位基因頻率為16.8%,經(jīng)χ2檢驗,差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.802,P=0.094),該位點基因型和等位基因頻率已達Hardy-Weinberg平衡,來自同一群體,具有群體代表性。

2.3 瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A多態(tài)性比較

酶切產(chǎn)物電泳后可分為3種基因型,AA、AG和GG(見附圖)。兩組基因型分布頻率比較,經(jīng)χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組等位基因分布頻率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

附圖 瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A多態(tài)性電泳圖

表3 兩組瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A基因型和等位基因的分布頻率比較 例(%)

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病慢性并發(fā)癥之一,也是導致終末期腎衰竭的主要病因之一[5]。至今,糖尿病腎病的發(fā)病機制尚不清楚,可能是多因素相互作用的結(jié)果[6]。其早期表現(xiàn)為腎小球高灌注、高濾過,然后出現(xiàn)蛋白尿,晚期表現(xiàn)為腎衰竭。JARDINE等[7]研究表明,糖代謝紊亂、高血壓、高血脂、糖尿病病程、性別、年齡等與糖尿病腎病的進展相關(guān)。本研究結(jié)果表明,2型糖尿病腎病組收縮壓、舒張壓、糖化血紅蛋白、BUN、SCr高于無糖尿病腎病組,而兩組UA、TG、TC、HDL-C、LDL-C、載脂蛋白A、載脂蛋白B無差別,與JARDINE等[7]的研究結(jié)果不完全相同。有研究表明,HbA1C、BUN、SCr、收縮壓、舒張壓與對照組相比顯著升高[8-10],與本研究結(jié)果一致。李澤宇等[10]研究指出,糖尿病組血脂水平與糖尿病腎病組有差別,與本研究結(jié)論不同,考慮可能與糖尿病腎病組患者服用降脂藥物有關(guān)。許多研究發(fā)現(xiàn),由脂肪組織產(chǎn)生的細胞因子在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,瘦素就是其中之一。MOON等[11]研究發(fā)現(xiàn),瘦素與糖尿病腎病發(fā)病有關(guān)。段永強等[12]研究表明,病例組與對照組的瘦素水平有差別,與本研究結(jié)論一致。瘦素是瘦素基因編碼的產(chǎn)物,主要由白色脂肪產(chǎn)生,是脂肪細胞分泌的肽類激素,由167個氨基酸組成,在調(diào)節(jié)機體能量平衡、體重及許多生理代謝方面起重要作用。MüNZHERG等[13]研究指出,瘦素促進細胞修復及血管形成。瘦素分泌受多種因素影響,其中基因調(diào)控區(qū)變異也是影響因素之一。瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A是較常見的單核苷酸多態(tài)性。有研究者稱該單核苷酸多態(tài)性或許從轉(zhuǎn)錄水平影響瘦素基因的表達及循環(huán)瘦素的高低[14]。王立坤等[15]研究表明,瘦素在糖尿病微血管病變形成過程中起重要作用。瘦素和瘦素受體基因多個位點存在多態(tài)性,許多研究證實,該基因多態(tài)性參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[14-15]。目前國內(nèi)外對瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A基因多態(tài)性相關(guān)疾病,如冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ㄒ韵潞喎Q冠心病)、高血壓等都有研究,但對2型糖尿病腎病研究甚少。譚藝青等[16]研究表明,瘦素rs4731426、rs2167270基因多態(tài)性與我國南方漢族人群冠心病無關(guān)聯(lián)。翟公偉[17]研究表明,瘦素基因啟動子-2548G/A存在不同的基因型,早發(fā)冠心病組與正常對照組基因型分布不同,該位點多態(tài)性與冠心病發(fā)病有關(guān),其中A等位基因可能是其發(fā)病的遺傳易感基因。本研究以瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A基因變異作為標記,探討該基因的變異和2型糖尿病腎病易感性的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)無糖尿病腎病患者與2型糖尿病腎病患者瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A基因多態(tài)性分布有差異,其中2型糖尿病腎病患者AA、AG基因型頻率和A等位基因的分布頻率較無糖尿病腎病組升高。

綜上所述,瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A多態(tài)性與2型糖尿病腎病患者有一定的相關(guān)性,A等位基因可能是其發(fā)病的易感基因。通過檢測基因型和等位基因頻率可以篩查2型糖尿病腎病。由于本研究樣本量小,尚需進行大樣本研究來證實,同時本研究為病例對照研究,驗證因果關(guān)聯(lián)能力弱,尚需前瞻性研究彌補不足。

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