，明春，， ，，

(1.貴州大學生命科學學院/農業(yè)生物工程研究院，貴州省農業(yè)生物工程重點實驗室/山地植物資源保護與種質創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，綠色農藥與農業(yè)生物工程國家重點實驗室培育基地，貴陽 550025；2.貴州省農業(yè)科學院 旱糧研究所，貴陽 550006)

玉米是主要的飼料和糧食作物。由于普通玉米缺乏人類及單胃動物所必需的賴氨酸，因此玉米的蛋白質營養(yǎng)價值不高。Mertz等發(fā)現，玉米奧帕克-2(opaque-2,o2)突變能顯著提高玉米籽粒胚乳中的賴氨酸含量[1]。后來新的類似突變被陸續(xù)發(fā)現，如floury1(fl1)[2]、floury2(fl2)[3-4]、floury3(fl3)[5-6]、opaque4[7]、opaque5[8-9]、opaque6[10-11]、proline1(pro1)[12]、De*-B30[13]和Mc[13]等，但這些突變均因幼苗致死或遺傳方式復雜等原因難于在育種與生產中應用。為擴寬高賴氨酸玉米的種質資源，Yang等利用Mu轉座子，選育出一個新的高賴氨酸突變體奧帕克-16(opaque-16,o16)，籽粒賴氨酸含量達0.36%以上[14]，可用于種質改良和品質育種[15-17]。

然而，單基因突變的高賴氨酸玉米不能滿足食用和食品加工的營養(yǎng)品質要求(0.5%以上)，更不能滿足畜禽飼料對賴氨酸含量的要求(0.6%～0.8%)。為進一步提高玉米賴氨酸含量，課題組利用分子標記輔助選擇技術(marker-assisted selection,MAS)，將o16和o2基因雜交和回交聚合，其籽粒賴氨酸含量可達0.5%以上[14,18]。Sarika等利用MAS將o2和o16基因回交滲入不同的輪回親本中，與輪回親本相比，其賴氨酸和色氨酸含量分別增加了76%和91%。糯玉米食味品質優(yōu)良，籽粒賴氨酸含量約為0.30%[17]。為提高糯玉米的賴氨酸含量，張曉星利用MAS技術，將o2基因回交滲入到糯玉米中，賴氨酸含量增加48.5%～61.9%[19]。Yang等利用雜交和回交選育模式，將o16基因滲入到wx玉米中，分別得到4個和3個家系，其中3個回交家系，其賴氨酸含量比糯玉米系提高18%～28%[20]。Zhang等利用分子標記輔助回交選擇技術，將o2和o16基因回交滲入到糯玉米中，得到3份含有o2和o16基因的糯玉米系，其平均籽粒賴氨酸含量為0.62%，糯性與輪回親本相當，可滿足人、畜、禽的食用和飼用需求[21-22]。但玉米o2，o16和wx基因聚合后提高品質的分子機理至今未知。

近等基因系(near-isogenic line,NIL)是進行遺傳研究的理想材料，尤其適用于基因的功能分析等?；诮然蛳档睦脙r值，有必要利用回交育種和分子標記輔助選擇技術，選育含有玉米o2，o16和wx基因不同類型的近等基因系材料，為闡明優(yōu)異基因聚合提高玉米營養(yǎng)品質的機理提供材料基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米o2、o16和wx三隱性基因聚合系QCL 8002-11是貴州省旱糧研究所選育的優(yōu)質蛋白糯玉米自交系，用作供體親本。CML 539為來源于國際小麥改良中心(CIMMYT)的普通玉米自交系。

1.2 群體構建

以普通玉米自交系CML 539為母本，o2、o16和wx三隱性基因聚合系QCL 8002-11(o2o2o16o16wxwx)為父本，雜交獲得F1，再利用CML 539為輪回親本構建回交BC1F1，BC2F1，BC3F1，BC4F1，BC5F1，BC6F1和BC6F2分離群體。

1.3 DNA提取與檢測

按照王偉等一種適用于玉米分子標記輔助育種的DNA提取方法(201711413562.9)專利進行。

1.4 SSR分子標記分析

利用o2基因內SSR標記umc 1066,phi 057和phi 112檢測o2基因型，利用與o16緊密連鎖的SSR標記umc 1141和umc 1121檢測o16基因型，利用wx基因內SSR標記phi 022、phi 027和phi 061檢測wx基因型。引物序列信息來源于www.maizegdb.org，由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 靶基因內或緊密連鎖的SSR引物信息

PCR反應體系(10μL)： 10×Buffer 1μL，MgCl2(25 mM)1μL，Glycerol(99%)1μL，Primer(5μM)(F) 0.6μL，Primer(5μM)(R) 0.6μL，dNTPs(2 mM)0.75μL，DNA模板(10 ng/μL)2μL，Taq(5 U/μL)0.075μL，ddH2O 2.975μL。PCR擴增程序：預變性 93 ℃ 1 min；變性93 ℃ 1 min，退火58 ℃ 2 min，延伸72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；延伸72 ℃ 5 min。PCR擴增反應在Thermal Cycler(manufactured by Applied Biosystems)上完成。利用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠對PCR擴增產物進行檢測。

圖1 玉米o2，o16和wx基因不同聚合類型近等基因系創(chuàng)制流程圖

注：1為CML 539;2為QCL 8002-11圖2 o2、o16和wx基因的SSR引物在親本間遺傳多態(tài)性

2 結果與分析

2.1 玉米o2，o16和wx基因不同聚合類型近等基因系創(chuàng)制流程

以QCL 8002-11(o2o2o16o16wxwx)為供體親本，CML 539為輪回親本，在BC1F1，BC2F1，BC3F1，BC4F1和BC5F1回交群體，用SSR標記選擇基因型為O2o2O16o16Wxwx的單株，利用CML 539回交。在BC6F1世代，用SSR標記選擇基因型為O2o2O16o16Wxwx的單株，自交獲得BC6F2。在BC6F2世代，用SSR標記選擇基因型為o2o2o16o16wxwx、o2o2o16o16、o2o2wxwx、o16o16wxwx、o2o2、o16o16和wxwx的單株自交，自交多代直至穩(wěn)定(圖1)。

2.2 SSR標記的多態(tài)性分析

利用o2基因內3個SSR標記phi 112、umc 1066和phi 057，wx基因內3個SSR標記phi 061、phi 027和phi 022，o16基因緊密連鎖的2個SSR標記umc 1141和umc 1121，對o2、o16和wx三基因聚合系QCL 8002-11和普通玉米自交系CML 539進行多態(tài)性檢測。結果，o2基因內標記phi 112在CML 539和QCL 8002-11間有很好的多態(tài)性，wx基因內標記phi 022、phi 027和phi 061在CML 539和QCL 8002-11間均有很好的多態(tài)性，o16基因連鎖標記umc 1141和umc 1121在CML 539和QCL 8002-11間均有很好的多態(tài)性(圖2)。本實驗選用SSR標記phi 112、phi 061和umc 1141對o2、wx和o16靶基因在BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC4F1、BC5F1、BC6F1和BC6F2分離世代進行選擇。

2.3 回交和自交世代目標基因標記選擇結果

2012年冬季，在海南以QCL 8002-11(o2o2o16o16wxwx)為供體親本，CML 539(wxwx)為輪回親本，構建雜交F1。2013春季，在貴陽種植F1世代，利用CML 539回交獲得BC1F1。2014年春季，在貴陽種植BC1F1世代分離群體，共174個單株，利用分子標記選擇基因型為O2o2O16o16Wxwx的單株，結果共選擇了17個單株，利用CML 539回交，獲得BC2F1種子。2014年冬季，在海南種植BC2F1世代分離群體，共204個單株，利用分子標記選擇基因型為O2o2O16o16Wxwx的單株，結果共選擇了22個單株，利用CML 539回交，獲得BC3F1種子。2015年春季，在貴陽種植BC3F1世代分離群體，共337個單株，利用分子標記選擇基因型為O2o2O16o16Wxwx的單株，結果共選擇了47個單株，利用CML 539回交，獲得BC4F1種子。2015年冬季，在海南種植BC4F1世代分離群體，共294個單株，利用分子標記選擇基因型為O2o2O16o16Wxwx的單株，結果共選擇了46個單株，利用CML 539回交，獲得BC5F1種子。2016年春季，在貴陽種植BC5F1世代分離群體，共287個單株，利用分子標記選擇基因型為O2o2O16o16Wxwx的單株，結果共選擇了35個單株，利用CML 539回交，獲得BC6F1種子。2016年冬季，在海南種植BC6F1世代分離群體，共295個單株，利用分子標記選擇基因型為O2o2O16o16Wxwx的單株，結果共選擇了38個單株，自交獲得BC6F2種子。2017年春季，在貴陽種植BC6F2世代分離群體，共1 032個單株，利用分子標記分別選擇基因型為o2o2o16o16wxwx、o2o2o16o16、o2o2wxwx、o16o16wxwx、o2o2、o16o16和wxwx的單株，自交獲得BC6F3。2017年冬季，在海南種植不同基因類型材料BC6F3世代，根據田間植株表現，分別選擇優(yōu)良單株自交獲得BC6F4。2018年春季，在貴陽種植不同基因類型材料BC6F4世代，選擇優(yōu)良單株繼續(xù)自交直至穩(wěn)定。最終獲得含有不同玉米基因類型的近等基因系材料o2o2o16o16wxwx6份，o2o2o16o16 7份，o2o2wxwx5份，o16o16wxwx7份，o2o2 6份，o16o16 6份和wxwx6份。

注：R，CML 539；D，QCL 8002-11。下同。圖3 引物phi 112檢測分離世代的基因型(2次上樣)

圖4 引物phi 061檢測分離世代的基因型(2次上樣)

圖5 引物umc 1141檢測分離世代的基因型(2次上樣)

2.4 玉米o2、o16和wx不同基因類型近等基因系果穗和籽粒表型觀察

自然光下觀察獲得的o2、o16和wx不同基因類型近等基因系果穗和籽粒表型，投射光下觀察籽粒透明性和胚乳縱橫斷面。結果，o2o16wx-NIL，o2o16-NIL，o2wx-NIL，o16wx-NIL，o2-NIL，wx-NIL，o16-NIL果穗形狀和輪回親本CML 539 基本一致，穗行數為12～14行，果穗為筒型(圖6，圖7)。獲得的o2o16wx-NIL,o2o16-NIL，o2wx-NIL，o16wx-NIL，o2-NIL和o16-NIL 6種不同基因類型近等基因系材料，籽粒均不透明，wx-NIL籽粒也不透明，為蠟質胚乳。而輪回親本CML 539籽粒種皮光滑有光澤，籽粒飽滿，透明，為角質胚乳(圖6，圖7)。

圖6 獲得的o2o16wx-NIL，o2o16-NIL，o2wx-NIL，o16wx-NIL和輪回親本的表型特征

圖7 獲得的o2-NIL，wx-NIL，o16-NIL和輪回親本的表型特征

3 結論與討論

本研究利用o2、o16和wx三隱性基因聚合系QCL 8002-11和普通玉米自交系CML 539為親本，再利用CML 539為輪回親本，將玉米o2、o16和wx基因滲入到CML 539系中，經回交6代和自交4代的選擇，獲得了含有o2、o16和wx基因不同聚合類型的近等基因系材料，對研究玉米品質性狀的遺傳改良和育種及分子機理具有重要意義。

張曉星等[19]利用o2玉米自交系CA 339和魯2548為供體材料，25個品質較好的糯玉米自交系為受體，利用回交育種和分子標記選擇技術，創(chuàng)制出了回交5代的糯玉米o2近等基因系材料，提高了糯玉米的營養(yǎng)價值和商品價值。以玉米o2、o16和wx三隱性基因聚合系QCL 8002-11和普通玉米自交系CML 539為親本，利用回交育種結合分子標記輔助選擇技術，快速實現了玉米o2、o16和wx三隱性基因一次性滲入普通玉米，再通過后代的分離，又選育出兩兩基因不同組合類型的材料，為多基因的遺傳改良提供了一種新的模式。