齊國雨，楊愛梅，鄭澤生，韓娜，張富祿，尚暉嵐

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)，為無患子科文冠果屬植物，為我國特有的珍稀木本油料作物[1]，其種子含油量40%～50%，種仁含油量高達(dá)65%[2]，文冠果油既是優(yōu)質(zhì)的食用油,也可以文冠果油為原料制備生物柴油[3]。文冠果的樹干、樹葉、種仁富含脂肪酸、氨基酸、皂苷、萜類、甾類多種具有生物活性成分[4]。這些活性成分對(duì)炎癥、腫瘤、病毒、HIV、提高記憶力均具有顯著療效[5]。

目前文冠果的主要利用方式是對(duì)其種仁進(jìn)行食用油或生物柴油的制備，廢棄的文冠果果殼不僅造成了資源的浪費(fèi)，亦對(duì)生態(tài)環(huán)境造成一定的負(fù)擔(dān)。因此本文擬對(duì)文冠果果殼提取物進(jìn)行初步的抗氧化試驗(yàn)和抑菌活性試驗(yàn)，以期為文冠果果殼的綜合開發(fā)與有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

文冠果果殼采自甘肅慶陽地區(qū)，由蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院楊林副教授鑒定。受試細(xì)菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),以上菌種保藏于蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院中藏藥提取分離技術(shù)實(shí)驗(yàn)室；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，抗壞血酸(Vc)(上海伊卡生物技術(shù)有限公司)、鐵氰化鉀、三氯乙酸(TCA)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma公司)、過氧化氫、硫酸亞鐵等。

1.2 主要儀器與實(shí)驗(yàn)設(shè)備

可見光分光光度計(jì)(721型),上海精科儀器有限公司;電子天平(FA2014),上海良平儀器儀表有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A),上海亞榮生化儀器有限公司;培養(yǎng)箱,江蘇中和實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;超凈工作臺(tái),江蘇凈化設(shè)備有限公司;高壓滅菌鍋；恒溫震蕩器；離心機(jī)。

2 方法

2.1 文冠果果殼95%乙醇提物及各極性萃取物的制備

文冠果果殼粉碎，過100目篩，取文冠果果殼粉200 g置于圓底燒瓶中，加入2 000 mL 95%工業(yè)乙醇，70℃回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇得總浸膏。將所得總浸膏用60℃～70℃的蒸餾水溶解，然后依次用石油醚(1 000 mL)、乙酸乙酯(1 000 mL)、正丁醇(1 000 mL)進(jìn)行萃取(每種溶劑萃取3次，每次6～8 h)，合并萃取液，減壓濃縮后得各極性萃取物。

2.2 體外抗氧化活性試驗(yàn)

(1)DPPH自由基的清除能力試驗(yàn)

試驗(yàn)組：移取樣液2 mL于試管中，加入0.05 mg/mL的DPPH乙醇溶液2 mL，搖勻，避光30 min，測(cè)其吸光度A樣品(517 nm)?？瞻捉M：無水乙醇設(shè)定為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度A空白(517 nm)。對(duì)照組：以無水乙醇替代DPPH乙醇溶液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)對(duì)照；抗壞血酸(Vc)為陽性對(duì)照，平行試驗(yàn)3組。根據(jù)公式：清除率(%)= [1 - (A樣品- A對(duì)照) /A空白]×100%計(jì)算清除率。

(2)羥基自由基的清除能力試驗(yàn)

試驗(yàn)組：移取樣液2 mL于試管中，加入1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，1 mL 0.1% H2O2溶液，10 mL定容，搖勻，37℃恒溫保溫0.5 h，測(cè)定吸光度A樣品(510 nm)。對(duì)照組：以蒸餾水代替0.1% H2O2溶液，測(cè)定吸光度A對(duì)照(510 nm)?？瞻捉M：以2 mL無水乙醇代替樣品溶液，測(cè)定吸光度A空白。抗壞血酸(Vc)為陽性對(duì)照，平行試驗(yàn)3組。按公式：清除率(%)= [1 - (A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100%計(jì)算清除率。

(3)總還原力試驗(yàn)

移取2.5 mL樣液于試管中，加入0.2 mol/L pH為6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，搖勻。水浴(50℃)20 min中后，迅速冷卻。加入10% TCA溶液2.5 mL，混勻，離心5 min(5 000 r/min)吸取上清液5 mL，向其中加入蒸餾水4 mL和 0.1% FeCl3溶液1 mL，混勻，靜置10 min，700 nm測(cè)定吸光度值(700 nm)?？箟难?Vc)為陽性對(duì)照，平行試驗(yàn)3組。

2.3 提取物抑菌活性試驗(yàn)

本試驗(yàn)以5種常見治病細(xì)菌為研究對(duì)象，采用牛津杯法[6-8]對(duì)文冠果果殼95%乙醇粗提取、石油醚萃取物、乙酸乙醋萃取物和正丁醇萃取物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。吸取200 μL各菌種菌懸液于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，均勻涂布，將無菌牛津杯立于培養(yǎng)基表面，輕壓，無空隙接觸培養(yǎng)基[9-11]。將不同濃度梯度待測(cè)樣液注入牛津杯中，以二甲基亞砜(DMSO)做空白對(duì)照，青霉素和硫酸鏈霉素為陽性對(duì)照品。恒溫培養(yǎng)箱37℃靜置培16～18 h后觀察受試菌生長狀況，記錄結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 體外抗氧化活性試驗(yàn)

3.1.1 DPPH自由基的清除能力試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如圖1、表1所示，石油醚萃取部位對(duì)DPPH自由基基本沒有清除能力，其余各部位對(duì)DPPH自由基均存在不同程度的清除能力，且樣品濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，樣品與陽性對(duì)照品(Vc)均清除率均達(dá)到最大。

3.1.2 羥基自由基的清除能力試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如圖2、表2所示，95%乙醇提取物及各極性萃取物對(duì)H2O2與FeSO4反應(yīng)所產(chǎn)生的·OH清除能力低于陽性對(duì)照品(Vc),其中95%乙醇提取物對(duì)·OH清除率基本為0，正丁醇部位萃取物對(duì)·OH清除能力最強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.25 mg/mL時(shí)，清除率不到10%。

圖1 提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

濃度石油醚乙酸乙酯正丁醇乙醇維生素C0.010.103 1000.081 90.235 00.020.137 800.007 30.140 40.368 00.040.335 30.036 80.011 00.266 60.702 00.050.516 60.116 30.016 90.333 10.852 00.10.835 20.517 70.061 70.575 60.923 00.20.957 90.894 50.127 20.831 40.967 70.50.959 30.961 70.261 00.929 40.968 00.750.972 40.951 70.358 00.928 90.968 3

圖2 提取物對(duì)羥基自由基的清除能力

濃度石油醚乙酸乙酯正丁醇乙醇0.010.014 40.013 70.016 10 0.020.024 80.045 00.047 90.002 00.040.053 60.057 70.082 60.003 00.080.061 10.068 90.085 40.004 50.160.064 10.072 60.090 10.005 10.20.068 00.073 50.095 10.008 20.250.069 10.077 90.100 10.019 3

3.1.3 總還原力試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如圖3、表3所示，陽性對(duì)照品(Vc)還原能力強(qiáng)于95%乙醇提取物和各極性萃取物。石油醚萃取物基本沒有還原能力，其余部位均具有不同程度的還原能力，吸光度值與濃度存在一定的量效關(guān)系，測(cè)試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。還原能力與待測(cè)物濃度成劑量依賴性，還原能力與斜率成正比。

圖3 提取物總還原能力測(cè)定

濃度石油醚乙酸乙酯正丁醇乙醇維生素C0.020.060 00.108 50.120 00.104 50.135 00.040.069 00.115 00.135 00.155 00.186 30.060.079 50.224 50.149 00.199 50.253 60.080.089 50.279 00.174 00.234 00.335 20.10.099 50.318 00.201 00.291 00.420 30.120.106 00.397 00.221 00.328 00.510 30.140.121 00.442 50.250 00.382 00.612 40.160.125 00.505 00.268 50.391 00.721 5

3.2 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

95%乙醇提取物及各極性部位萃取物對(duì)五種受試細(xì)菌最低抑菌濃度的確定,結(jié)果見表4。四個(gè)樣品對(duì)五種受試細(xì)菌在較低濃度均有抑菌作用。其中乙酸乙酯萃取物對(duì)肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌以及地衣芽胞桿菌最低抑菌濃度為2.5 mg/mL，表明乙酸乙酯萃取物中含有抑菌活性成分，有必要進(jìn)一步跟蹤分離研究該部位的化學(xué)成分。正丁醇萃取物在較低濃度下對(duì)五種受試菌均有抑菌作用，其中對(duì)大腸桿菌最低抑菌濃度為2.5 mg/mL。

表4 樣品對(duì)五種受試細(xì)菌的MIC值確定結(jié)果(mg·mL-1)

4 結(jié)論與討論

結(jié)果表明, 文冠果果殼95%乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物均具有清除DPPH自由基活性、清除羥基自由基活性以及還原力。但活性與陽性對(duì)照品抗壞血酸(Vc)相比較低。樣品對(duì)金黃色葡萄球菌 、地衣芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌均具有較好的抑菌活性，其中乙酸乙酯萃取部位抗氧化活性及抑菌活性均較好，將在后續(xù)研究中對(duì)其中的抑菌及抗氧化活性單體成分進(jìn)行跟蹤分離。