王香雨，陳百靈，李紅杰，賈慶忠*

(1.河北醫(yī)科大學藥理教研室，河北 石家莊 050017；2.定州市中醫(yī)院，河北 定州市 073000)

柴貝胃炎康是一個由柴胡、芍藥、枳實等多味藥材組成的臨床經(jīng)驗方處方由傳統(tǒng)方劑“四逆散”和“左金丸”加減裁化而成。四逆散源于《傷寒論》可用于肝胃不和引起的胃痛、腹痛。有研究表明四逆散加減方可治療急慢性應激性胃潰瘍[1]。左金丸是《丹溪心法》中的名方主治肝火犯胃證、脅肋疼痛、嘈雜吞酸。現(xiàn)代研究表明左金丸具有抑制基礎(chǔ)泌酸和抗?jié)兊乃幚碜饔肹2]。柴貝胃炎康以柴胡為君藥配伍枳實、白芍、黃連等治療急慢性胃潰瘍。有臨床研究表明四逆散合左金丸合方可治療膽汁反流性胃炎、功能性消化不良[3-4]。但尚未有實驗研究該合方對應激性胃潰瘍及慢性胃潰瘍的治療作用。應激性胃潰瘍及慢性胃潰瘍臨床發(fā)病率高但其發(fā)生的確切機制尚不明確因此防治效果不理想。因此尋找對應激性胃潰瘍及慢性胃潰瘍的藥物意義重大。本實驗所用四逆散合左金丸加減方以生藥微粉方式經(jīng)口給藥提高了吸收度，方中以柴胡為君藥，具有疏肝利膽、理氣解郁以祛發(fā)病之源；枳實疏散行氣，有驅(qū)肝郁氣滯之功效；白芍益肝扶脾；黃連清瀉肝火，可治肝火犯胃之癥。配以海螵蛸等名貴藥材，可治療胃潰瘍等多種胃部疾病。采用急性水浸應激模型和乙酸灼燒慢性潰瘍實驗動物模型觀察該方對胃組織形態(tài)、胃潰瘍面和胃酸分泌、胃蛋白酶含量等指標的影響評價其主要藥效作用。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

柴貝胃炎康膠囊由北京祥和康健科技發(fā)展有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品批號：20150907。

奧美拉唑浙江華立南湖制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格20 mg/片批號：151003。

1.2 動物清潔級

KM小鼠雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g,由河北省實驗動物中心提供合格證號：1601187。SPF級SD大鼠雌雄各半，體質(zhì)量180～250 g,由中國食品藥品檢定研究院提供合格證號：11400500012734。

1.3 試劑

冰醋酸購于天津市永大化學試劑有限公司批號20130824。

1.4 儀器

電子天平,梅特勒—托利多(上海)有限公司生產(chǎn),型號:AL204。解剖顯微鏡,OLYMPUS公司生產(chǎn),型號:SZX12。顯微鏡,Olympus公司生產(chǎn),型號:CH型。微量注射器,上海醫(yī)用激光儀器廠生產(chǎn),型號:0.25 ML。切片機,德國Leica公司生產(chǎn),型號:RM2135。攤片機,中國天津航利達公司生產(chǎn),型號:TP-1。烘片機,中國天津航利達公司生產(chǎn),型號:HP-1。病理工作站,德國Leica公司生產(chǎn),型號:DM2500。

1.5 方法

1.5.1 應激性胃潰瘍實驗分組、給藥和取材

KM小鼠60只體質(zhì)量18～20 g,按性別、體質(zhì)量隨機分為5組,每組12只。設(shè)模型對照組、陽性對照組(奧美拉唑8 mg/kg)、供試品三個劑量組,0.6 g、1.2 g、2.4 g/kg相當于臨床推薦劑量的6、12、24倍。藥物組采用等容積不等濃度灌胃,每日1次，給藥容積為0.1 mL/10 g體質(zhì)量。模型組給予等量0.5%的CMC-Na,每日1次。連續(xù)5 d,第4天開始禁食不禁水。第5天給藥后30 min,將小鼠仰臥固定于鐵絲網(wǎng)板，浸于(20±1)℃水槽內(nèi),水面齊劍突[5]。16 h后頸椎移位處死動物、剖腹、結(jié)扎幽門和賁門,向胃內(nèi)注入1%福爾馬林1.5 mL固定30 min。沿胃大彎將胃壁剪開，將其平鋪透光玻璃板上,讀取潰瘍點數(shù)目或潰瘍指數(shù),并計算潰瘍抑制率。

1.5.2 乙酸灼燒形成的胃潰瘍實驗分組、給藥和取材

SD大鼠60只,體質(zhì)量180～200 g，按性別、體質(zhì)量隨機分為5組，每組12只,雌雄各半。大鼠胃體與幽門交界處注入10% 醋酸50 μL，形成丘疹，制備酸刺激慢性潰瘍模型，按性別、體質(zhì)量隨機分為模型對照組(0.5% CMC-Na),陽性對照組(給予奧美拉唑8 mg/kg),供試品低、中、高三個組(給藥劑量分別為0.4 g、0.8 g、1.6 g/kg，此劑量分別相當于臨床推薦劑量4、8、16 倍)。以上各組動物均灌胃給藥每日1次，連續(xù)灌胃14 d。術(shù)前禁食不禁水，末次給藥后3h 在幽門與十二指腸結(jié)合部位結(jié)扎，術(shù)后6h 測量取胃內(nèi)容物，用于測量胃蛋白酶活性、胃液總量及游離酸含量。沿胃大彎剪開,將胃壁展開，觀察胃壁損傷情況并照相,用ImageJ軟件分析胃壁損傷面積和愈合百分率。每組取6只胃組織置于10%福爾馬林固定常規(guī)石蠟包埋切片蘇木素-伊紅染色(HE染色)作常規(guī)組織病理學觀察。應用定量分析系統(tǒng)光鏡下測定胃潰瘍深度及炎癥反應程度,按文獻標準[6]并加以改進，用半定量法判定胃壁病變程度。見表1。

表1 組織病理學標準

1.5.3 指標觀察與檢測方法

1.5.3.1 潰瘍指數(shù)

用潰瘍長度總和(毫米數(shù))作為潰瘍指數(shù)，潰瘍抑制率(%)=(對照組潰瘍長度總和-給藥組潰瘍長度總和)/模型對照組潰瘍長度總和×100%[6]。

1.5.3.2 胃酸測定

收集全部胃液于離心管中3 000 r/min 離心15 min吸取上清為胃液量。 胃液游離酸量：取胃液1 mL置于燒杯中用pH計監(jiān)測pH，用20 mmol/L NaOH液滴定至pH=7時為游離酸滴定終點,記錄消耗NaOH體積。消耗NaOH液毫升數(shù)×20×總胃液量為游離酸量(mmol)[7]。胃液總酸度： 取胃液1 mL置于燒杯中加入酚酞指示劑2滴,用0．02 mol/LNaOH液滴定至微紅色、作為總酸度滴定終點。兩次滴定消耗的NaOH液毫升數(shù)×20為總酸度(mmol/L)?？偹崃?總酸度×胃液量(mmol)。單位時間酸排出量(mmol/h) =總酸度×總胃液量÷6[7]。

1.5.3.3 胃蛋白酶活性采用Mett毛細玻管法

胃蛋白酶活性計算公式(U/ML)=平均值×16[8]。

1.5.3.4 胃內(nèi)壁損傷面的測量

將損傷部位照相，圖片導入電腦用ImageJ軟件測量損傷面積，并計算。損傷面積比率=損傷面大小/整個胃內(nèi)表大小×100%。

1.5.3.5 大鼠實驗性胃潰瘍組織病理學程度分級標準

取材：5組動物中每組取6只(雌雄各3只)：沿小彎打開胃，從前胃至腺胃縱切取3～5條組織，固定，脫水，制作蠟塊。

1.6 統(tǒng)計學分析方法

2 結(jié)果

2.1 柴貝胃炎康膠囊對應激性小鼠胃潰瘍模型的影響

與模型組比較，奧美拉唑組小鼠潰瘍點數(shù)和潰瘍面長度均顯著減輕并且有統(tǒng)計差異(P<0.05)，柴貝胃炎康0.6 g/kg、1.2 g/kg、2.4 g/kg三個劑量組也有明顯減輕趨勢，并且0.6 g/kg和2.4 g/kg組有顯著性差異(P<0.01)。高劑量組潰瘍制率達67%，比奧美拉唑組49%還高，但無統(tǒng)計差異，詳見表2。結(jié)果提示柴貝胃炎康對小鼠水浸應激性胃潰瘍的有明顯的保護作用。

表2 柴貝胃炎康對應激性胃潰瘍模型小鼠的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 柴貝胃炎康對乙酸灼燒形成的胃潰瘍大鼠模型的影響

2.2.1 對大鼠胃酸、胃液及胃蛋白酶分泌的影響

胃酸分泌情況可通過胃液中游離酸量、總酸量、總酸度和單位時間排酸量進行考察。與模型組比較，奧美拉唑無論是從泌酸總量還是從單位時間分泌量，減少程度均有非常明顯差異 (P<0.01)，柴貝胃炎康低、中、高三個劑量組胃酸分泌減少，均有顯著性差異(P<0.05)，結(jié)果詳見表3。幽門結(jié)扎6 h后測量產(chǎn)生的胃液總量和胃蛋白酶活性，與模型組比較奧美拉唑?qū)ξ敢毫考拔傅鞍酌富钚跃鶡o顯著影響(P>0.05)，柴貝胃炎康膠囊各劑量組對胃蛋白酶活性影響不明顯，但是0.8 g/kg、1.6 g/kg 組胃液量顯著減少(P<0.05)，胃蛋白酶活總量有增多趨勢但無顯著性差異(P>0.05)，詳見表4。

表3 柴貝胃炎康對乙酸灼燒致大鼠胃酸分泌的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

表4 對大鼠潰瘍胃蛋白酶活性影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2.2 對胃壁灼燒創(chuàng)面的愈合效果觀察

通過ImageJ軟件對胃壁損傷面積進行測量，以分析創(chuàng)面愈合效果，評價藥物的治療作用。與模型組比較，奧美拉唑明顯減少損傷面積絕對值，同時降低損傷面積比例(P<0.01)。柴貝胃炎康低、中、高三個劑量組損傷面積比例也顯著降低(P<0.01)，各劑量組與奧美拉唑組比較均無顯著性，結(jié)果見表5。

表5 柴貝胃炎康對胃壁損傷面積比例的影響

注：與模型組比較，*P<0．05，**P<0．01

2.2.3 對胃潰瘍組織病理學的影響

每組取6只動物，將損傷部位胃組織取材后固定，HE染色觀察(見圖1)。模型組6只動物中4只均出現(xiàn)黏膜至肌層新鮮出血、黏膜下層淤血以及膜局部壞死和局部肌肉壞死。另外兩只動物出現(xiàn)輕度黏膜下層水腫及局部黏膜增厚。奧美拉唑組可見1例黏膜層黏膜下層和肌層的新鮮出血，其它5只動物胃組織出現(xiàn)輕度黏膜下層水腫及局部黏膜增厚。柴貝胃炎康高劑量組可見一例雄性動物胃漿膜層區(qū)域性炎細胞浸潤；中劑量組可見1例黏膜下層區(qū)域性新鮮出血，漿膜外異物肉芽腫；低劑量組可見輕度黏膜下層水腫及局部黏膜增厚。將每只動物病理觀察結(jié)果進行半定量評分(見表6)，結(jié)果提示柴貝胃炎康可促進乙酸灼燒引發(fā)的潰瘍面愈合。

表6 柴貝胃炎康對乙酸灼燒胃組織病變程度的評分影響

注:A.為模型組;B.為陽性藥奧美拉唑組;C.為柴貝胃炎康0.4 g/kg劑量組;D.為柴貝胃炎康0.8 g/kg劑量組;E.為柴貝胃炎康1.6 g/kg劑量組；M.表示雄性;F.表示雌性圖1 柴貝胃炎康對乙酸灼燒致胃潰瘍大鼠組織病理學影響

3 討論

實驗性胃潰瘍模型造模方法很多，包括水浸應激、幽門結(jié)扎、乙醇灌胃、非甾體抗炎藥及利血平等藥物誘導、乙酸或磷酸刺激等方法[9]。其中水浸應激致胃潰瘍的動物模型，主要是由于消化系統(tǒng)易受環(huán)境和情緒的影響，利用小鼠懼水習性造成一定程度的心理應激，由此導致中樞下丘腦—垂體—腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary- adrenal axis，HPA)被激活，從而使大腦皮層調(diào)控失衡，釋放大量兒茶酚胺類神經(jīng)激素，收縮胃壁血管及毛細血管，使胃黏膜微循環(huán)血流量減少、黏膜缺血，導致營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣減少表皮細胞損傷后無法修復再生；繼發(fā)性的氧自由基增加使得血管通透性增加以及黏膜水腫。由于胃黏膜微循環(huán)血流量是重要的胃黏膜保護屏障，胃黏膜缺血而形成應激損傷均出現(xiàn)不同程度潰瘍甚至糜爛[10]。本方中君藥柴胡、枳實為君藥可疏肝解郁、行氣散結(jié)從中醫(yī)理論來說肝主疏泄促氣血于全身可促進胃部微循環(huán)合理再分布。從而達到治療潰瘍的作用,本實驗結(jié)果也顯示合方對于抑制潰瘍有效果。

總之，通過對“四逆散”和“左金丸”等經(jīng)典名方加減裁化而成的柴貝胃炎康膠囊，無論是對水浸應激導致的急性胃潰瘍，還是對乙酸刺激形成的慢性胃潰瘍均表現(xiàn)出較好的治療作用，提示在其擬定的臨床使用劑量下可用于急慢性胃潰瘍的治療。