寇書萌,李頌碩,肖 明

(1.上海辰山植物園，上海 201602；2.上海師范大學，上海 200234)

1 引言

草原是世界上分布范圍最廣的植被類型之一，是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。我國草地面積為60億畝，居世界第二位，占世界草地13%，占全國陸地總面積41%，是耕地的3倍，林地的4倍[1]。但由于長時間以來對草地資源的重要性認識不足，使草地資源一直存在重農(nóng)輕牧、重牧輕草、重用輕管等不合理利用的問題，造成草原三化(退化、沙化、堿化)日趨嚴重，其中內(nèi)蒙古草原退化面積占42%。為此，加強對草原生態(tài)系統(tǒng)退化的生物學機制研究，改善退化生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)效益、提高其生物生產(chǎn)力已成為目前亟待解決的重要課題。

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizae，AM )真菌能與陸地生態(tài)系統(tǒng)中80%以上的高等植物形成菌根結構，并對植物群落的物種組成及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要作用。AM真菌通過在土壤中形成菌絲橋將不同的植物物種緊密的聯(lián)系在一起，而C、N、P等礦質(zhì)營養(yǎng)可通過菌絲橋在不同植物物種間進行轉移和分配。國際上一直非常重視對AM真菌的研究，更有學者指出，土壤中AM真菌的種類組成，物種豐富度的變化直接影響到植物群落的組成和結構，其多樣性是影響植物多樣性、植物生產(chǎn)力和群落穩(wěn)定性的重要因素，因此研究AM真菌的多樣性對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定有著重要的意義和作用。

本研究通過測定內(nèi)蒙古草原長期放牧干擾形成的不同退化程度下土壤因子和牧草根段侵染率的變化，探究AM真菌侵染率與土壤因子的相關性。并運用PCR-DGGE技術，研究不同退化程度下土壤AM真菌多樣性的變化，并嘗試根據(jù)土壤因子分析引起這種變化的因素。為科學管理和合理開發(fā)利用微生物資源、恢復退化草地的生物學功能提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 研究區(qū)域與樣地概況

研究地位于內(nèi)蒙古呼倫貝爾市陳巴爾虎旗好力堡嘎查附近，該地地處內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市西北部，地處呼倫貝爾大草原腹地，地理坐標為48°48′～50°12′N，118°22′～121°02′E。屬中溫帶半干旱大陸性氣候，春季氣溫回升快、變幅大、大風日數(shù)多，天氣變化劇烈。據(jù)氣象站多年觀測，年平均風速為3.5 m/s，主導風向為西北、西南，大風日多發(fā)生在春、秋季，春季平均風速達5.1 m/s，每月日平均風速大于或等于8 m/s的日數(shù)為18 d左右，秋季平均風速3.8 m/s。全年降水量為300 mm；年平均溫度-1.5 ℃。夏季多雨、溫和、潮濕，也是降雨集中的季節(jié)，占全年降水量的71%，是牧草繁殖生長的主要季節(jié)；秋季氣溫開始逐漸下降、降水量明顯減少，為40～45 mm，占全年降水量的15%左右；冬季漫長而嚴寒，降水以雪的形式出現(xiàn)。

研究地主要生態(tài)建群為羊草(Leymus chinensis)，土壤類型為栗鈣土，草原退化成輻射狀變化。根據(jù)草地利用情況和利用程度，以及草地植被的現(xiàn)況，依照李博提出的草地退化分級及其劃分標準[2]，在植被、土壤和地形條件相對一致的地段設置了不同退化程度的研究樣地，即未退化草場(No degradation, UD)，輕度退化草場(Light degradation，LD)，中度退化草場(Moderate degradation,MD)，重度退化草場(Highly degradation,HD)。圖1為采樣地點，表1所示為不同退化程度草場地理位置、放牧強度、植被狀況。

圖1 采樣地點表1 不同退化程度草場的地理位置、放牧強度、植被狀況(N=4)

采樣地地理位置海拔/m土壤類型產(chǎn)草量/(kg/畝)蓄載量/(畝/頭、牛)平均草高/cm植被覆蓋度/%未退化草場N 48°57′4.5″E 119°26′14.1″680栗鈣土6010～1244.892輕度退化草場N 48°56′30.0″E 119°25′19.0″685栗鈣土4710～1539.490中度退化草場N 48°55′53.6″E 119°26′11.8″658栗鈣土3530～3527.440重度退化草場N 48°54′42.0″E 119°26′40.7″655栗鈣土2040～506.255

2.2 土壤樣品采集與處理

2014年8月，于每個退化程度的樣地按五點取樣法挖取根圍土層0～10 cm剖面的土壤樣品及部分根系，裝入塑封袋內(nèi)，并分別標注UD、LD、MD、HD。帶回實驗室后，4 ℃保存，風干、研磨、過1 mm篩后用于土壤理化性質(zhì)分析及酶活的測定，過2 mm篩后-20 ℃保存用于分子生物學分析。

2.3 測定方法

2.3.1 土壤理化性質(zhì)及酶活性測定方法

土壤含水量的測定采用烘干法；土壤團聚體測定采用人工篩分法；pH值測定采用電位法；電導率采用雷磁電導率儀測定；有效磷含量采用鉬銻抗比色法；總碳含量測定采用重鉻酸鉀容量法；總氮含量測定采用凱氏定氮法；蔗糖酶活性的測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法；脲酶活性的測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法；堿性磷酸酶的測定采用磷酸苯二鈉比色法[3]。

2.3.2 牧草根段菌根侵染率測定方法

將牧草根系用清水沖洗干凈，剪成0.5～1.0 cm的小根段放入粗試管中，加入10% KOH溶液，放在90 ℃恒溫水浴鍋中40 min(20～60 min，幼嫩根時間可短一點，老硬根則需較長時間)，然后用清水輕輕沖洗根段3～4遍，再加入2%的HCl溶液浸泡酸化5 min，去除酸液后，再加入0.01%的酸性品紅乳酸甘油染色液，室溫下過夜。再加入乳酸進行分色，于Olympus顯微鏡下觀察測定AM真菌侵染狀況[4]。

采用根斷侵染加權法[5]按照公式計算樣品根系菌根的侵染率：

牧草根段侵染率(%)=∑(0%×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%…+100%×根段數(shù))/觀察總根段數(shù)

(1)

2.3.3 土壤DNA提取與純化

準確稱取0.5±0.05g土壤樣品，通過SDS高鹽裂解法提取土壤總DNA，并采用康為世紀公司的快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Gel Extraction Kit CW2302)對提取的DNA進行純化，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.4 AM真菌特異性片段PCR擴增

將所得的DNA適當稀釋后，作為模板進行PCR擴增。第一次PCR：引物為真菌18S rDNA 通用引物GeoA2和Geol1，反應程序為94 ℃ 4 min 預變性；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；2 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測。第二次PCR：第一次PCR產(chǎn)物稀釋100倍后作為模板進行第二次PCR擴增，所用引物為AM1和NS31-GC。反應程序為94 ℃ 2 min預變性；94 ℃ 45 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行檢測。第三次PCR：第二次PCR產(chǎn)物稀釋100后作為模板進行第三次PCR擴增，所用引物為NS31-GC和Glo1。反應程序為94 ℃ 2 min預變性；94 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。三次PCR擴增反應體系均為：10μL ddH2O，0.5μL BSA，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，1.0μL模板和12.5μL TaqDNA聚合酶[6]。

2.3.5 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

將第三次PCR產(chǎn)物10μL用DGGE儀(北京君意電泳設備有限公司，JY-TD331A型變性梯度凝膠電泳系統(tǒng))進行DGGE分析。按照制造商要求進行樣品處理、電泳、銀染等操作，當觀察到DNA條帶清晰可見時，終止顯影，并拍照記錄實驗結果。

表2 用于AM真菌特異性片段巢式PCR擴增的

注：NS31-GC的5’端接：CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG

2.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析方法

所有數(shù)據(jù)輸入Microsoft Excel 2007進行整理，后使用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析和相似性分析(P<0.05)。采用凝膠分析軟件Quantity-One(Bio-Rad)輸出各泳道各條帶的峰面積和亮度峰值，并計算物種豐富度(Species richness, S)，AM真菌多樣性指數(shù)(Shannon diversity index, H)和均勻度指數(shù)(Evenness index)，采用NTsys 2.10進行聚類分析采用UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means)算法，并生成系統(tǒng)樹圖。物種豐富度以樣品內(nèi)出現(xiàn)的條帶數(shù)來表示。微生物結構多樣性用Shannon指數(shù)H來表示，H的計算是基于DGGE條帶的位置和條帶的強度，而條帶的強度則通過條帶的峰面積來表示，具體公式如下：

Shannon diversity index=H=-∑(ni/N)In(ni/N)

(2)

式(2)中ni為第i個種的亮度峰值，N為所有物種亮度峰值之總和。

均勻度指數(shù)Evenness index=H/InS。

3 結果與分析

3.1 不同退化程度草原土壤理化性質(zhì)的變化特征

土壤理化性質(zhì)分析(表3)表明，土壤含水量隨草地退化程度的加深呈現(xiàn)遞減趨勢，各處理組間存在顯著差異。土壤退化在很大程度上取決于土壤水分條件的變化，隨放牧強度的提高，牲畜“蹄耕”表土并導致土壤水分含量逐步下降的效應非常明顯。土壤中直徑大于0.25 mm的土壤結構體被統(tǒng)稱為土壤團聚體，它是土壤中養(yǎng)分和水分的“藏庫”，其含量的多少，在一定程度上反映了土壤存儲養(yǎng)分和保蓄水分的能力，其對土壤的農(nóng)學價值起著主要的作用[10]。未退化草場的土壤團聚體結構數(shù)量最高，土壤結構更加黏重緊實，含水量也相對較高。隨退化程度的加深，各樣地土壤團聚體結構數(shù)量急劇下降，嚴重退化草地的土壤團聚體結構數(shù)量為7.77%，僅為未退化草地的1/5。土壤酸堿性對土壤其它性質(zhì)有較大的影響，如土壤微生物的活動、土壤有機質(zhì)的分解、土壤營養(yǎng)元素的釋放與轉化以及土壤發(fā)生過程中元素的遷移等都與酸堿性有關[11,12]。土壤pH值隨草地退化程度的加深而上升，UD與LD間無顯著差異。說明退化會導致土壤堿化，而堿性土壤不利于植被的生長。EC值用來測量土壤中可溶性鹽的濃度，土壤可溶性鹽濃度高會使植物受到損傷或造成植株根系的死亡。不同退化程度草原土壤EC值之間存在顯著差異，并隨退化程度的加劇而升高，HD、MD樣地的可溶性鹽含量較高，均大于1000 μs/cm。重度退化樣地的海拔相對較低(UD：680 m，LD：685 m，MD：658 m，MD：655 m)，由于微地形的變化，使土壤鹽分易堆積，其它礦化成分頻繁改變。土壤有效磷含量是衡量土壤磷素供應狀況的重要指標，它在土壤肥力診斷與施肥方面具有較大意義[13]。土壤有效磷含量在各退化程度樣地之間呈現(xiàn)出LD>UD>MD>HD的趨勢，輕度退化與未退化草地之間無顯著差異。土壤全氮含量是衡量土壤氮素供應狀況的重要指標[14]?？偟侩S退化程度的加深，呈現(xiàn)遞減趨勢，輕度退化與中度退化之間無顯著差異?？偺己縿t呈現(xiàn)UD>MD>LD>HD的變化趨勢，且各樣地間存在顯著差異。

表3 不同退化程度草原土壤理化性質(zhì)的變化特征 (N=4)

注：根據(jù)最小顯著差異差數(shù)法(LSD)，標記相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，標記不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3.2 不同退化程度草原土壤酶活性的變化特征

土壤酶是目前公認的可以作為評價土壤質(zhì)量的指標之一，其中脲酶參與土壤氮素轉化，為作物生長提供氮源，蔗糖酶參與土壤碳循環(huán)[15]，堿性磷酸酶的酶促作用能夠加速脫磷速度, 提高土壤磷素的有效性[16]。

不同退化程度草原土壤酶活性變化如表4所示，脲酶活性隨退化程度的加深，呈現(xiàn)遞減趨勢，且各處理組間存在顯著差異。各樣地蔗糖酶活性和堿性磷酸酶活性則呈現(xiàn)出LD>UD>MD>HD的變化趨勢，且各樣地間存在顯著差異。

表4 不同退化程度草原土壤酶活性的變化特征(N=4)

注：根據(jù)最小顯著差異差數(shù)法(LSD)，標記相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，標記不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3.3 不同退化程度下牧草根段菌根侵染率的變化特征

在所有處理組中的牧草根部都發(fā)現(xiàn)了泡囊(Vesicle)、菌絲(Hyphae)、叢枝(Arbuscules)的結構(圖2)。隨退化程度加深，菌根侵染率隨之下降，各樣地間侵染率存在顯著差異，如圖3所示。

圖2 牧草根段的叢枝(a)、菌絲(b)、泡囊(c)結構

3.4 AM真菌侵染率與土壤因子的相關性

由表5可知，AM真菌侵染率與土壤含水量、脲酶活性呈顯著正相關，與土壤pH值、EC值呈顯著負相關，說明土壤含水量直接影響AM真菌菌絲的延伸，水分含量低且高鹽堿的土壤不適合AM真菌菌絲的擴散和延伸。脲酶是將酰胺態(tài)有機氮化物水解轉化為植物可以直接吸收利用的無機氮化物的酶[17]，AM真菌的侵染有助于土壤氮素轉化。AM真菌侵染率與土壤有效磷、總氮、總碳、蔗糖酶、堿性磷酸酶無顯著相關性。

圖3 牧草根段AM真菌侵染率表5 不同AM真菌侵染率與土壤因子的相關性

指標含水量pH值EC有效磷總氮總碳脲酶蔗糖酶堿性磷酸酶侵染率0.965?-0.961?-0.959?0.5970.8720.7760.967?0.7590.855

注：*表示兩者之間在P<0.05水平上有顯著相關性

3.5 不同退化程度草原土壤AM真菌PCR-DGGE分析

應用DGGE技術分離不同退化程度草原土壤AM真菌18S rDNA區(qū)域片段PCR產(chǎn)物(圖4)，可以看出，不同退化程度草原土壤樣品DGGE電泳條帶數(shù)目、強度均有差異。根據(jù)DGGE實驗原理，每條條帶都代表一個AM真菌分子種。應用Quantity One (Bio-Rad)對獲得的DGGE圖譜進行條帶分析，扣除10%的背景強度，獲得圖譜中條帶數(shù)量。由于不同退化程度樣地間植物種類組成不同，各樣地AM真菌種類、優(yōu)勢種都存在差異。但由于本研究的樣地選在天然羊草草地上，雖然各退化程度樣地中植物種類有所不同，卻仍然存在共有植物，因此在各樣地的DGGE圖譜中仍存在共同條帶但亮度不同，即擁有共同的AM真菌種類，但相對多度不同。

圖4 PCR-DGGE分析不同退化程度草原土壤AM真菌的多樣性

3.6 聚類分析

為研究不同退化程度土壤樣品AM真菌的相似性，由Dice系數(shù)按照UPGMA算法計算各泳道樣品相似性的矩陣(表6)，繪出DGGE條帶的系統(tǒng)樹圖(圖5)。

表6 各泳道樣品相似性的矩陣

圖5 各泳道DGGE條帶的系統(tǒng)樹

聚類分析表明：所有土壤樣品的相似性為51%，在相似性62%時可以分成二類，第一類是樣品HD；第二類是樣品MD、UD；MD、UD的相似性最高，達到71%；土壤樣品LD與其他土壤樣品的相似性最低，為51%。

3.7 AM真菌群落多樣性分析

對DGGE圖譜上條帶峰值和條帶數(shù)進行分析可知，不同退化程度草原土壤AM真菌菌種數(shù)較少，多樣性指數(shù)(Shannon diversity index)和均勻性指數(shù)(Evenness index)總體較低。AM真菌多樣性、豐富度、均勻度變化趨勢呈現(xiàn)LD>UD>MD>HD。

表7 各樣地AM真菌多樣性指數(shù)、豐富度、均勻度

不同退化程度草地之間，輕度退化程度的AM真菌多樣性高于未退化草地，似乎與一般生態(tài)演替規(guī)律相反。這可能是由于隨著土壤自身生存環(huán)境的改變，土壤中大量有機殘體轉化，從而使土壤肥力在這一階段內(nèi)有所提高。放牧是草原最主要的利用方式，過度放牧導致土壤理化性質(zhì)變差且生物活性下降，AM真菌多樣性降低，適度放牧有助于土壤理化性質(zhì)和生物活性的恢復，促進土壤物質(zhì)的循環(huán)過程。AM真菌多樣性變化符合Connell等提出的“中度干擾假說”(Intermediate disturbance hypothesis)，即中等程度的干擾使多樣性維持較高水平，它允許更多的物種入侵和定居。也就是說，適度干擾可提高土壤活性，有利于退化草場的恢復(表7)。

3.8 AM真菌多樣性與土壤因子相關性分析

相關性分析結果顯示(表8)，AM真菌多樣性指數(shù)、物種豐富度、均勻度都與有效磷、堿性磷酸酶活性呈顯著正相關(P<0.05)；與蔗糖酶活性呈極顯著正相關(P<0.01)；與含水量、pH值、EC值、總碳、總氮、脲酶活性雖具有一定的相關性，但并無顯著關系。

在植物的土壤磷素營養(yǎng)中，有機磷化合物占有一定的比例，而有機磷往往要在土壤磷酸酶的酶促作用下，才能轉化成為植物可能利用的形態(tài)。所以，土壤磷酸酶的活性直接影響土壤中磷的有效性[18]。本研究中，AM真菌多樣性指數(shù)、物種豐富度、均勻度 AM 真菌與堿性磷酸酶活性呈顯著正相關(P<0.05)，說明土壤有機磷轉化和利用直接影響AM真菌的生長和寄主。

蔗糖酶是能把高分子化合物分解成植物和微生物能利用的營養(yǎng)物的水解酶之一，為土壤生物體提供充分能源，其活性反應了土壤有機碳積累與分解轉化的規(guī)律[19]。AM真菌多樣性、豐富度、均勻度與蔗糖酶活性呈極顯著正相關(P<0.01)，說明土壤有機碳積累與分解轉化直接影響到AM真菌的生長發(fā)育與宿主代謝。

表8 不同AM真菌侵染率與土壤因子的相關性

注：*表示兩者之間在P<0.05水平上有顯著相關性；**表示兩者之問在P<0.01水平上有極顯著相關性

4 討論

為研究草場退化程度與土壤AM真菌多樣性和土壤因子的相關性，本實驗在內(nèi)蒙古呼倫貝爾市陳巴爾虎旗好力堡嘎查附近設置了不同退化程度的研究樣地，即未退化草場(No degradation, UD)、輕度退化草場(Light degradation，LD)、中度退化草場(Moderate degradation , MD)和重度退化草場(Highly degradation , HD)，并于2014年8月采集土壤及根系樣品作為實驗樣本進行研究。土壤的理化性質(zhì)分析結果表明：土壤含水量隨草地退化程度的加深呈現(xiàn)遞減趨勢，各處理組間存在顯著差異；隨放牧強度的增加，退化程度的加深，各樣地土壤團聚體結構數(shù)量逐漸下降；土壤pH值和EC值隨退化程度的加劇而升高；土壤有效磷含量在各退化程度樣地之間呈現(xiàn)出LD>UD>MD>HD的趨勢，總碳含量則呈現(xiàn)UD>MD>LD>HD的變化趨勢，這些結果與其他一些學者的研究結果相一致，即適度放牧可以加速土壤中養(yǎng)分循環(huán)，但總氮含量卻未顯示出此種趨勢，其會隨退化程度的加深呈現(xiàn)遞減趨勢；土壤脲酶活性隨退化程度的加深，呈現(xiàn)遞減趨勢；蔗糖酶活性和堿性磷酸酶活性則呈現(xiàn)出LD>UD>MD>HD的變化趨勢。隨草原退化程度加深，AM真菌菌根侵染率隨之下降，各樣地間侵染率存在顯著差異。本研究采用SDS高鹽裂解法從土壤樣品中抽提總DNA，總DNA經(jīng)試劑盒純化后，利用巢式PCR擴增AM真菌基因片段，于擴增得到大約230bp的條帶。經(jīng)PCR-DGGE分析，不同退化程度草原土壤AM真菌多樣性指數(shù)總體較低，AM真菌多樣性指數(shù)、豐富度、均勻度變化均趨勢呈現(xiàn)LD>UD>MD>HD的趨勢。這與戎郁萍、高雪峰等人的研究結果相一致，即輕度的放牧利于土壤微生物的繁殖[20,21]。經(jīng)相關性分析發(fā)現(xiàn)AM真菌侵染率與土壤含水量、脲酶活性呈顯著正相關，與土壤pH值、EC值呈顯著負相關，與土壤有效磷、總氮、總碳、蔗糖酶、堿性磷酸酶無顯著相關性。AM真菌多樣性指數(shù)、物種豐富度、均勻度都與有效磷、堿性磷酸酶活性呈顯著正相關；與蔗糖酶活性呈極顯著正相關。

在日趨嚴重的過牧和天然因素的綜合影響下，草原退化帶來嚴重的生態(tài)環(huán)境問題。為了草原地區(qū)的可持續(xù)發(fā)展，應當建立合理的草原利用制度，科學控制載畜量，減少過度的人為干擾；因地制宜采取圍封保護或輪牧制度[22]。