單 宇，魯雯嫻，廖雨琴，祝宇翀，劉軍權(quán)

(杭州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，浙江杭州 310053)

幽門(mén)螺桿菌是胃炎、消化性潰瘍和胃癌的重要致病因子[1-2]。目前，臨床對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染治療大多是經(jīng)驗(yàn)用藥，隨著感染人群中幽門(mén)螺桿菌耐藥菌株的不斷增加，經(jīng)驗(yàn)性用藥治療失敗率越來(lái)越高。為指導(dǎo)Ⅰ期臨床用藥，提高幽門(mén)螺桿菌治療精準(zhǔn)性、敏感性，迫切需要實(shí)驗(yàn)室提供幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)和藥敏結(jié)果。由于幽門(mén)螺桿菌需要在微需氧的特殊環(huán)境和較高營(yíng)養(yǎng)條件生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)成功率較低，使得許多醫(yī)院都不愿開(kāi)展幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)。近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)許多第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)針對(duì)臨床需求，紛紛開(kāi)展幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)和差異化服務(wù)。第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)為了資源共享，大多將周邊區(qū)域的幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)樣本集中送往中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，這勢(shì)必會(huì)因標(biāo)本運(yùn)輸時(shí)限，使采集的樣本不能及時(shí)送檢或接種，致使幽門(mén)螺桿菌自然死亡率增高，降低了幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)成功率，影響臨床抗幽門(mén)螺桿菌用藥選擇。為觀察樣本貯存時(shí)間、溫度和運(yùn)輸工具對(duì)幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)結(jié)果的影響，本研究將樣本貯存在不同溫度下，并以差異化時(shí)間接種培養(yǎng)幽門(mén)螺桿菌樣本，以了解條件的改變對(duì)幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1培養(yǎng)液種類(lèi) 幽門(mén)螺桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基(固-液雙相)購(gòu)自珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)益民生物工程制品廠(批號(hào)：20180730)；血瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司(批號(hào)：20180726B)；苛養(yǎng)菌藥敏瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司(批號(hào)：20180719B)。

1.1.2鑒定試劑 VITEK MS-CHCA 基質(zhì)購(gòu)自生物梅里埃公司(批號(hào)：1006062980)；尿素酶購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司(批號(hào)：170103)；觸酶和氧化酶購(gòu)自重慶龐通醫(yī)療器械有限公司(批號(hào)分別為：18D0804和18D1805)。

1.1.3儀器 梅里埃質(zhì)譜儀VITEK MS購(gòu)自生物梅里埃公司；TDR-Y100型微需氧培養(yǎng)儀和微需氧培養(yǎng)氣體(10%二氧化碳+10%氫氣+氮?dú)馄胶鈿?購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙天地人生物科技有限公司；標(biāo)本運(yùn)輸箱購(gòu)自廣州賽信冷鏈冷藏科技有限公司；D-1-70型自動(dòng)控制壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；HSX-250型電熱恒溫恒濕箱購(gòu)自中儀國(guó)科(北京)科技有限公司；DW-86L338型-80 ℃超低溫保存箱購(gòu)自青島海爾特種電器有限公司；DW-YW166A型-25 ℃冰箱購(gòu)自中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；DW-YL450型4 ℃冰箱購(gòu)自中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；BSC-1500IIB2-X型生物安全柜購(gòu)自山東濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；CX21FS1C型生物顯微鏡和BX43F型攝像顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1樣本制備 原代幽門(mén)螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43504以TSB基質(zhì)配制濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳腋∫?約1×108CFU/mL)。按以下步驟進(jìn)行連續(xù)稀釋?zhuān)?1)1∶00稀釋?zhuān)何∩鲜黾?xì)菌懸液0.1 mL加入9.9 mL TSB中。(2)再1∶100稀釋?zhuān)何?jīng)(1)稀釋后懸液0.1 mL加入9.9 mL TSB中。(3)再1∶100稀釋?zhuān)何?jīng)(2)稀釋后懸液0.1 mL加入9.9 mL TSB中。此時(shí)幽門(mén)螺桿菌濃度為(100±10)CFU/mL，然后將此濃度的幽門(mén)螺桿菌菌液加入運(yùn)輸培養(yǎng)基中，每支1 mL，共75支。此試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2樣本包裝 將標(biāo)本放置于特殊包裝箱中。包裝箱必須具備，(1)主容器用足量的吸附性材料進(jìn)行包裹，以便在發(fā)生滲漏時(shí)可以吸收所有液體。(2)中層包裝，為第2層耐用、水密性、防滲漏的包裝，把主容器裝入其中并對(duì)其起保護(hù)作用。(3)外包裝，中層包裝置于外包裝內(nèi)，并加墊適宜的緩沖材料。外包裝應(yīng)能保護(hù)其內(nèi)容物在運(yùn)輸時(shí)不受外界的影響，如遭受物理性損壞。外層容器的最小一面的尺寸≥10 cm×10 cm。將制備完成的樣本放置于特殊包裝箱中進(jìn)行相關(guān)貯存試驗(yàn)。

1.2.3樣本貯存 把已接種菌液的幽門(mén)螺桿菌運(yùn)輸培養(yǎng)基分別置于4、25、35、-25、-80 ℃環(huán)境中，分別存放6.0、12.0、24.0、48.0 h后進(jìn)行微需氧培養(yǎng)。

1.2.4樣本的運(yùn)輸 汽車(chē)運(yùn)輸：將標(biāo)本置于4 ℃冷鏈運(yùn)輸箱由本公司冷鏈運(yùn)輸車(chē)運(yùn)送至杭州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所樣本接收組，并及時(shí)遞交至微生物室，所有樣本存放總時(shí)間為7.0 h后接種。在車(chē)上時(shí)間為6.0 h。火車(chē)運(yùn)輸：將標(biāo)本置于4 ℃冷鏈運(yùn)輸箱，通過(guò)安檢并進(jìn)行交接登記。當(dāng)日上午約9:00從杭州托遠(yuǎn)，至下午15：00左右樣本到達(dá)廣州高鐵站，由廣州運(yùn)務(wù)組提貨，在16：00前交接進(jìn)入廣州金域標(biāo)本組并及時(shí)遞交至微生物室，所有樣本存放總時(shí)間為7.0 h后接種，在車(chē)上時(shí)間約為6.0 h。飛機(jī)運(yùn)輸：將標(biāo)本置于4 ℃冷鏈運(yùn)輸箱，通過(guò)安檢并進(jìn)行交接登記，由杭州經(jīng)航空運(yùn)送到達(dá)廣州白云機(jī)場(chǎng)，并及時(shí)遞交至微生物室，所有樣本存放總時(shí)間為7.0 h后接種。在空中時(shí)間約為2.5 h。

1.2.5培養(yǎng)和鑒定 接種：將接收到經(jīng)不同貯存溫度、貯存時(shí)間和不同運(yùn)輸工具處理后的樣本立即接種在生物安全柜內(nèi)，吸取運(yùn)輸培養(yǎng)基中全部(1.0 mL)樣本接種于血瓊脂平板，用接種環(huán)進(jìn)行3區(qū)劃線，置于37 ℃ 微需氧，濕度95%環(huán)境中培養(yǎng)，3～6 d內(nèi)觀察培養(yǎng)結(jié)果。

幽門(mén)螺桿菌的鑒定:(1)顯微鏡下幽門(mén)螺桿菌形態(tài)鑒定。吸取1滴無(wú)菌生理鹽水于潔凈載玻片上，用無(wú)菌接種環(huán)取單一菌落在鹽水中涂開(kāi)，蓋上蓋玻片，普通顯微鏡下觀察。(2)涂片染色方法。吸取1滴無(wú)菌生理鹽水于潔凈載玻片上，用無(wú)菌接種環(huán)取單一菌落在生理鹽水中均勻涂開(kāi)，自然干燥后按常規(guī)方法進(jìn)行革蘭染色。(3)氧化酶試驗(yàn)。準(zhǔn)確加1滴試劑到空白紙片上(直徑6 mm)，將菌落涂在紙片上。10～30 s內(nèi)出現(xiàn)紫色為陽(yáng)性，無(wú)顏色改變或延遲反應(yīng)為陰性。觸酶試驗(yàn)：用無(wú)菌環(huán)或針，從平板上挑取單個(gè)菌落，置于載玻片上，滴加1滴觸酶檢測(cè)試劑。產(chǎn)生大量氣泡為陽(yáng)性，沒(méi)有氣泡產(chǎn)生為陰性。尿素酶試驗(yàn)：挑取大量培養(yǎng)18.0～24.0 h待試菌培養(yǎng)物接種于含液體培養(yǎng)基的試管中，搖均，于(36±1)℃培養(yǎng)10 min、1.0 h、2.0 h，分別觀察結(jié)果。如陰性繼續(xù)培養(yǎng)至4 d，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽(yáng)性。梅里埃質(zhì)譜儀VITEK MS鑒定:在VITEK MS-DS靶板點(diǎn)位制備成菌液檢測(cè)樣點(diǎn)，立即加1 μL VITEK MS-CHCA基質(zhì)液,等待基質(zhì)完全干燥并形成結(jié)晶后放入質(zhì)譜儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1培養(yǎng)和形態(tài) 固體培養(yǎng)到第3天時(shí)，幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)良好，哥倫比亞血瓊脂平板上見(jiàn)透明、針尖樣菌落形態(tài)；液體培養(yǎng)第3天時(shí)可見(jiàn)培養(yǎng)基明顯渾濁，涂抹少量菌液于無(wú)抗菌藥物的哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)，肉眼未見(jiàn)污染菌生長(zhǎng)，并有透明、針尖樣的菌落長(zhǎng)出；在無(wú)菌生理鹽水中：革蘭染色后細(xì)菌為革蘭陰性，固體培養(yǎng)基中的幽門(mén)螺桿菌為螺旋狀、海鷗狀、s狀彎曲菌或短桿菌；液體培養(yǎng)基中的幽門(mén)螺桿菌則多為螺旋短桿狀，亦見(jiàn)部分長(zhǎng)絲狀細(xì)菌，有的互相纏繞聚集成團(tuán)，有的散在分布，革蘭染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2鑒定結(jié)果 觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性；梅里埃質(zhì)譜儀VITEK MS 鑒定為幽門(mén)螺桿菌。

2.3貯存溫度和貯存時(shí)間對(duì)幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)的影響 樣本貯存溫度與存放時(shí)間對(duì)結(jié)果有非常顯著性影響。在24.0 h內(nèi)相同貯存時(shí)間以貯存4 ℃時(shí)培養(yǎng)陽(yáng)性率最高(40.4%±5.1%)，與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在貯存6.0 h以?xún)?nèi)以貯存25 ℃時(shí)陽(yáng)性率最高(71.2%±8.1%)，與35、-25、-80 ℃比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同貯存時(shí)間以-80 ℃結(jié)果最穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

注：與相同運(yùn)輸時(shí)間貯存25 ℃結(jié)果比較，*P<0.05;與相同貯存溫度的0.0 h結(jié)果比較，#P<0.05

注：與相同運(yùn)輸工具貯存6.0 h結(jié)果比較，*P<0.05； 與相同運(yùn)輸時(shí)間對(duì)照結(jié)果比較，#P<0.05

2.4不同運(yùn)輸條件對(duì)幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)的影響 樣本經(jīng)過(guò)汽車(chē)、高鐵、飛機(jī)運(yùn)輸后對(duì)幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)均有影響，以飛機(jī)運(yùn)輸影響最明顯。樣本經(jīng)過(guò)飛機(jī)運(yùn)輸后幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)死亡率非常高，大多樣本無(wú)菌生長(zhǎng)。運(yùn)輸工具與貯存時(shí)間對(duì)幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討 論

幽門(mén)螺桿菌為革蘭染色陰性無(wú)芽胞、呈螺旋狀彎曲的桿菌，不僅寄生于胃腸道，而且在口腔及呼吸系統(tǒng)均分離到細(xì)菌，在人群中感染率達(dá)50%以上。據(jù)報(bào)道，幽門(mén)螺桿菌感染是消化系統(tǒng)慢性炎癥、胃部潰瘍、胃黏膜淋巴組織異常和淋巴瘤的主要致病菌和胃癌的一級(jí)致癌因子[3-9]。目前對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染診斷方法種類(lèi)眾多，不同方法檢出的陽(yáng)性率差異明顯，有許多確定性方法如病理檢查、基因診斷等[10]。但如果進(jìn)行致病機(jī)制、細(xì)菌分型、耐藥菌株、疫苗制備等研究，幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)法是“金標(biāo)準(zhǔn)”[11]。

國(guó)內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)，幽門(mén)螺桿菌在遠(yuǎn)離消化系統(tǒng)的其他器官中也能引起一系列的疾病，如幽門(mén)螺桿菌與維生素B缺乏[12]、特發(fā)性血小板減少性紫癜[13]、缺鐵性貧血[14]有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌與神經(jīng)[15]、頭頸部[16]、婦科疾病[17]、心血管[18]、糖尿病[19]和代謝綜合征[20-21]等相關(guān)。幽門(mén)螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA)是冠心病的危險(xiǎn)因素，是ST段抬高型心肌梗死復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因子[22]；幽門(mén)螺桿菌感染與阿爾茨海默病、癡呆、血管性疾病有關(guān)；還與頭頸部疾病、復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍、牙周炎、青光眼、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變有關(guān)，可能是由于幽門(mén)螺桿菌定植于耳、鼻、咽喉所致。幽門(mén)螺桿菌在慢性阻塞性肺疾病中可能是致病因子。另外，感染CagA陽(yáng)性的幽門(mén)螺桿菌可能導(dǎo)致男性不育，并與女性中妊娠期糖尿病有關(guān)[23]。

隨著臨床抗菌藥物的大量使用，幽門(mén)螺桿菌耐藥菌株的發(fā)生率日趨嚴(yán)重，但目前幽門(mén)螺桿菌的培養(yǎng)條件、藥敏試驗(yàn)在我國(guó)仍難以常規(guī)開(kāi)展，臨床根除性治療幽門(mén)螺桿菌多是按經(jīng)驗(yàn)用藥。由于幽門(mén)螺桿菌的體外培養(yǎng)不僅對(duì)培養(yǎng)基、儀器、操作技術(shù)等有特殊要求，對(duì)氣體環(huán)境更為敏感，幽門(mén)螺桿菌需在微需氧環(huán)境下生長(zhǎng)，而大氣中和絕對(duì)厭氧的環(huán)境中不能生長(zhǎng)，還需保持95%以上的相對(duì)濕度和37 ℃的溫度，且樣本離體后自然死亡率隨著存放時(shí)間和環(huán)境溫度改變對(duì)培養(yǎng)結(jié)果有非常顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，幽門(mén)螺桿菌在24.0 h小時(shí)內(nèi)相同貯存時(shí)間以4 ℃環(huán)境保存的樣本培養(yǎng)陽(yáng)性率最高；貯存6.0 h以?xún)?nèi)以25 ℃陽(yáng)性率最高，陽(yáng)性率明顯高于貯存35、-25、-80 ℃環(huán)境。樣本長(zhǎng)時(shí)間保存時(shí)以-80 ℃結(jié)果最穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幽門(mén)螺桿菌樣本經(jīng)過(guò)汽車(chē)、高鐵、飛機(jī)運(yùn)輸對(duì)幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)均有影響，以飛機(jī)運(yùn)輸影響最明顯。樣本經(jīng)過(guò)飛機(jī)運(yùn)輸后幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)成功率很低，大多樣本無(wú)菌生長(zhǎng)，可能高空的外在氣壓改變使樣本處于低氧環(huán)境下對(duì)幽門(mén)螺桿菌生存存在干擾，本結(jié)果與郭春亮等[24]研究相符，他們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，常規(guī)法、加氧法和加壓加氧法培養(yǎng)幽門(mén)螺桿菌的陽(yáng)性率分別為1.1%、34.4%和31.7%，相同幽門(mén)螺桿菌菌株在相同的培養(yǎng)條件下，低氣壓的高原地區(qū)幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)緩慢且菌落數(shù)顯著低于平原地區(qū)，主要原因是低氣壓可致環(huán)境低氧，從而影響幽門(mén)螺桿菌的存活。

4 結(jié) 論

幽門(mén)螺桿菌樣本最佳存放溫度和接種時(shí)間：如能在6.0 h內(nèi)接種，保存于25 ℃環(huán)境培養(yǎng)陽(yáng)性率最高；24.0 h內(nèi)接種，保存于4 ℃環(huán)境培養(yǎng)陽(yáng)性率最高；長(zhǎng)時(shí)間保存時(shí)以-80 ℃結(jié)果最穩(wěn)定。飛機(jī)運(yùn)輸時(shí)由于低氣壓可致樣本處于低氧環(huán)境，從而影響幽門(mén)螺桿菌的存活。因此，實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)時(shí)，采集的樣本需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況選擇最合適的貯存時(shí)間、貯存溫度和運(yùn)輸方式，以提高幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率。