王亞敏 ， 謝夢洲 ，3，張超文 ，陳光宇 ，瞿昊宇 ，宋毓?jié)?，朱建平

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙 410208；2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410208；3.抗腫瘤中藥創(chuàng)制技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南長沙 410007）

湯劑的形式既符合中國傳統(tǒng)的健康飲食方式，又是中醫(yī)傳統(tǒng)有效服藥劑型，特別是對于補(bǔ)益類中藥來說，湯劑熱服使熱氣推行更有利于發(fā)揮補(bǔ)益作用，參山固體飲料是將藥食同源中藥和藥食兩用真菌有機(jī)結(jié)合，既能以巧妙的配比充分發(fā)揮中藥復(fù)方與菌湯獨(dú)特鮮美風(fēng)味，又能通過中藥提取工藝優(yōu)化和菌湯熬煮工藝的優(yōu)化充分發(fā)揮中藥復(fù)方與藥食用真菌的功效，參山固體飲料在選方配伍上以健脾益腎法為依據(jù)，以減輕腫瘤患者因癌性疲乏癥狀為目標(biāo)，選藥均為藥食同源藥材，以人參大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾養(yǎng)胃，山藥益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾肺腎為君，茯苓利水滲濕、健脾安神，枸杞子、桑葚補(bǔ)益肝腎、滋陰生津?yàn)槌?，共奏健脾利濕、補(bǔ)腎養(yǎng)陰之效，玫瑰花疏肝解郁、活血行氣，再與既能健脾益氣、又鮮香濃郁的藥食兩用真菌配合，使中藥復(fù)方提取物和食用菌提取物在功效和風(fēng)味上相輔相成，既能固護(hù)患者胃氣、調(diào)補(bǔ)氣血，也能增進(jìn)患者食欲，提高患者對藥膳類產(chǎn)品的接受度。由于中藥復(fù)方中人參、桑葚、玫瑰花的醇溶性成分人參皂苷、白藜蘆醇、黃酮和水溶性成分多糖等皆有抗腫瘤、增加免疫力的活性[1-2]，而茯苓、枸杞子、山藥的活性成分主要為多糖類屬于水溶性成分[3-4]，研究采用先醇提人參、桑葚、玫瑰花，醇提藥渣與茯苓、枸杞子、山藥一并水提，可以最大程度地提取中藥中的有效活性成分，以達(dá)到提高功效的目的。主要研究了參山固體飲料的提取工藝，獲得最優(yōu)提取參數(shù)，以期為中試和工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜系統(tǒng)，包括G1316A型四元梯度泵、G1313A型標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型恒溫箱、G1314A型紫外檢測器、Agilent Chemstation色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品；UV9100B型紫外可見分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器股份有限公司產(chǎn)品；YP-B5001型電子天平，上海光正醫(yī)源儀器有限公司產(chǎn)品；RHP-400型高速多功能粉碎機(jī)，浙江永康市榮浩工業(yè)有限公司產(chǎn)品；SHH.W21型電子三用水箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；YJD20型老藥師常溫煎藥機(jī)，長沙市卓成醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；RE-200013型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 藥材及試劑

人參（人工種植）、桑葚、玫瑰花（重瓣紅玫瑰）、枸杞子、茯苓、山藥等藥材，購于老百姓大藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周日寶教授鑒定符合2015版《中國藥典》一部項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定；人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-200726） 購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-200921），購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；人參皂苷Re對照品（批號：110702-200925），購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；無水葡萄糖對照品（批號：110833-201506），購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；甲醇、乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其他HPLC用試劑皆為色譜純；5%苯酚、濃硫酸、乙醚、無水乙醇等比色用試劑皆為國產(chǎn)分析純試劑。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸比色法測定參山固體飲料水提液中多糖的含量

2.1.1 對照品溶液制備

取無水葡萄糖對照品約0.025 g，精密稱定，置250 mL量瓶中，加適量水溶解，稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為0.100 4 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 參山固體飲料水提液供試品溶液的制備[5-6]

精密移取各工藝條件下制得的醇提樣品液（相當(dāng)于生藥量0.5 g），加乙醚100 mL加熱回流1 h，靜置，放冷，小心棄去乙醚液，殘?jiān)盟∩蠐]盡乙醚。加入80%乙醇100 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過，濾渣與濾器用80%乙醇30 mL分次洗滌，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水150 mL，加熱回流2 h。趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至250 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得供試品1；吸取2 mL供試品1置10 mL試管中，加水至刻度線，得供試品2。精密吸取1 mL供試品2，加入1 mL蒸餾水，5%的苯酚1 mL，5 mL濃硫酸，搖勻，室溫置10 min，于40℃水浴加熱15min，冷卻至室溫，在最大吸收波長處測定吸光度A。

2.1.3 最大吸收波長的選擇

精密吸取葡萄糖對照品溶液和參山固體飲料中藥復(fù)方水提樣品溶液1 mL，按照2.1.2項(xiàng)下方法于波長400～600 nm處分別進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果對照液和供試液最大吸收波長皆在490 nm，故選擇490 nm為測定波長。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取無水葡萄糖對照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中并加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，各再精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，于室溫下放置10 min，置40℃水浴加熱15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，于波長490 nm的最大吸收波長處測定吸光度。以吸光度對無水葡萄糖溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得線性方程：Y=0.017 176+0.043 539X，R=0.992 9。

2.1.5 方法學(xué)考查

儀器精密度RSD為1.96%，供試品溶液在6 h內(nèi)吸光度穩(wěn)定，測定應(yīng)在6 h內(nèi)完成。重復(fù)性試驗(yàn)RSD為4.831%，加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，參山固體飲料部分藥材的醇提樣品液中多糖平均回收率為102.3%，RSD為2.218%。

2.2 HPLC法測定參山固體飲料醇提液中人參皂苷Rg1，Re，Rb1的含量

2.2.1 色譜條件[7-8]

Ultimate 3000型色譜柱；固定相為C18烷基鍵合硅膠；流動(dòng)相為水-乙腈；運(yùn)行時(shí)間30min；檢測波長203 nm；柱溫30℃；按人參皂苷Rg1，Re，Rb1分別計(jì)算理論塔板數(shù)＞4 000，分離度＞1.5。

2.2.2 人參皂苷Rg1，Re，Rb1對照品溶液的配制

稱取人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re對照品各10 mg，分別精密稱定為0.010 3，0.010 1，0.010 4 g，各置于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，充分搖勻，制得人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密移取參山固體飲料部分藥材的醇提各樣品液適量，過0.22μm微孔濾膜至進(jìn)樣小瓶中，即制得部分藥材醇提供試品溶液。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備

按處方比例稱取除去人參的其他藥材，依照醇提液的制備工藝和供試品溶液的處理方法制備陰性對照品溶液。

2.2.5 人參皂苷Rg1，Re，Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍

取1.03 mg/mL的人參皂苷Rg1，1.01 mg/mL的人參皂苷Rb1，1.04 mg/mL的人參皂苷Re對照品溶液分別依次稀釋成 100，90，80，70，60，50，40，30，20，10μg/mL的質(zhì)量濃度，按2.2.1項(xiàng)下色譜分離條件進(jìn)樣10μL，測定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，分別以人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度、人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度、人參皂苷Re質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，人參皂苷Rg1線性回歸方程為Y=0.802 8X+0.146 3，R2=0.999 4；人參皂苷Rb1線性回歸方程為Y=0.795 4X+0.276 3，R2=0.999 7；人參皂苷Re線性回歸方程為Y=0.387 1X+0.159 3，R2=0.999 2，即人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re對照品溶液質(zhì)量濃度在10～100μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 分離條件的考查

精密吸取對照品溶液10μL，供試品溶液、陰性對照品溶液各20μL，分別注入高效液相色譜儀，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上有一相同的色譜峰，而陰性對照液未見干擾。

對照品（由左到右依次為人參皂苷Re，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1）見圖1，參山固體飲料部分中藥醇提樣品供試液見圖2，陰性對照品溶液見圖3。

圖1 對照品（由左到右依次為人參皂苷Re，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1）

圖2 參山固體飲料部分中藥醇提樣品供試液

圖3 陰性對照品溶液

2.2.7 方法學(xué)考查

人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re的儀器精密度RSD分別為1.012%，1.089%，1.062%；供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定，測定應(yīng)在48 h內(nèi)完成；重復(fù)性試驗(yàn)RSD分別為1.871%，1.764%，1.683%；加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，參山固體飲料部分藥材的醇提樣品液中人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re平均回收率分別為100.2%，100.6%，98.87%；RSD分別為0.86%，0.62%，0.66%。

參山固體飲料部分中藥醇提次數(shù)的考查見表1，參山固體飲料部分中藥醇提正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2，參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)見表3。

2.3 參山固體飲料醇提工藝條件研究

2.3.1 參山固體飲料部分中藥醇提基本方法

將人參、桑葚、玫瑰花，加一定濃度一定藥材倍量的乙醇，浸泡一定時(shí)間，回流一定時(shí)間，同法回流2次或3次，過濾合并濾液，濃縮并定容至一定體積。

表1 參山固體飲料部分中藥醇提次數(shù)的考查

表2 參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表3 參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.3.2 參山固體飲料部分中藥醇提次數(shù)的考查

取人參、桑葚、玫瑰花3份，每份100 g，按表1設(shè)計(jì)方案中的參數(shù)分別回流法醇提，制備3份醇提液，于50℃下減壓濃縮并定容至100 mL，按2.2.3分別處理成供試液，每份按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10μL，測定3種人參皂苷含量。

參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素間方差分析見表4。

表4 參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素間方差分析

由表4可知，醇提2次3種人參皂苷之和提取量占醇提3次的95%以上，故醇提2次為佳。

2.3.3 參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、加醇量（倍）、醇提時(shí)間（h）、浸泡時(shí)間為考查因素，以3種人參皂苷之和百分比（%）為評價(jià)指標(biāo)值，選用四因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)法進(jìn)行醇回流提取2次，考查各因素不同水平對3種人參皂苷含量的影響，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差和方差分析，篩選最優(yōu)醇提工藝參數(shù)，由于以人參皂苷含量為主要指標(biāo)，參考文獻(xiàn)[8]中對人參皂苷的提取因素及水平，設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)水平間方差分析見表5。

表5 參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)水平間方差分析

由極差R值可知，4個(gè)因素對參山固體飲料醇提液中3種人參皂苷含量影響大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)（A） ＞ 加醇量 （B） ＞ 浸泡時(shí)間 （D） ＞ 醇提時(shí)間（C）；A因素及水平（除2水平與3水平外） 皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B因素1水平與3水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C因素和D因素及水平間皆無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從表7，表8和經(jīng)濟(jì)成本角度考慮，參山固體飲料醇提最佳提取工藝條件為A1B1C1D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，浸泡 1 h，加醇量為生藥量的12倍和8倍，醇回流提取1.5 h和1.0 h，由于該醇提條件系第1列試驗(yàn)號，所以不必驗(yàn)證。

2.4 茯苓、枸杞子、山藥與醇提藥渣一并水提工藝條件研究

2.4.1 參山固體飲料中藥水提基本方法

將茯苓、枸杞子、山藥加一定量水浸泡2 h，加入醇提藥渣一并水提回流2次或3次，每次水提回流一定時(shí)間，過濾，合并濾液，濃縮至一定體積。

2.4.2 參山固體飲料中藥復(fù)方水提次數(shù)考查

取茯苓、枸杞子、山藥3份，每份100 g，分別浸泡，加入醇提藥渣，按表6設(shè)計(jì)方案中的參數(shù)分別水提，制備3份水提液，于50℃下減壓濃縮至100 mL，按2.1.2分別處理成供試液，每份按2.1項(xiàng)下測定多糖含量。

參山固體飲料中藥復(fù)方水提次數(shù)考查設(shè)計(jì)見表6。

表6 參山固體飲料中藥復(fù)方水提次數(shù)考查設(shè)計(jì)

由表6可知，水提2次多糖提取量占水提3次的94%以上，故水提2次為佳。

2.4.3 參山固體飲料中藥復(fù)方水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果分析

選取水提溫度（℃）、加水量（倍）、水提時(shí)間（h） 為考查因素，以多糖含量（%） 為評價(jià)指標(biāo)值，選用三因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)法進(jìn)行水回流提取2次，考查各因素不同水平對多糖含量的影響，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差和方差分析，篩選最優(yōu)水提工藝參數(shù)。

茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提因素與水平設(shè)計(jì)見表7，茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提正交試驗(yàn)見表8，茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提方差分析見表9。

表7 茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提因素與水平設(shè)計(jì)

表8 茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提正交試驗(yàn)

表9 茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提方差分析

由極差R'值可知，3個(gè)因素對茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提藥液中多糖含量的影響順序?yàn)樗釡囟龋ˋ'）＞水提時(shí)間（C'）＞加水量（B'）；A'、B'、C'三因素及水平間皆無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度考慮，茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提最佳工藝條件為A'3B'1C'1，即水提溫度100℃，加水量為生藥量的15倍和10倍，水提時(shí)間1.5 h和1.0 h。

2.4.4 茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

取茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣（人參、桑葚、玫瑰花）混合，按水提最優(yōu)工藝參數(shù)為水提2次，水提溫度100℃，浸泡2.0 h，加水量為生藥量的15倍的10倍，水提時(shí)間1.5 h和1.0 h，平行試驗(yàn)3次。

水提驗(yàn)證結(jié)果見表10。

表10 水提驗(yàn)證結(jié)果

由表10可知，多糖含量高于正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排表中的任何一列數(shù)據(jù)，表明水提工藝科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可行，可重復(fù)。

3 結(jié)論

（1）參山固體飲料由藥材和食材組成，中藥復(fù)方提取液濃縮后再噴霧干燥成粉和菌湯噴霧干燥所得粉按比例混和，組方和工藝均兼顧口感和功效，是典型的具有中醫(yī)藥膳特色的現(xiàn)代產(chǎn)品劑型，對藥材提取這部分工藝及參數(shù)進(jìn)行了試驗(yàn)研究，為后續(xù)部分的噴霧干燥制成中藥干浸膏粉和菌湯粉工藝研究奠定基礎(chǔ)和提供依據(jù)，具有實(shí)用意義和應(yīng)用價(jià)值。

（2）乙醇體積分?jǐn)?shù)、加醇量、浸提時(shí)間對藥材中人參皂苷的提取量影響顯著。從理論上講提取次數(shù)越多越好，提取次數(shù)太多，時(shí)間周期長，效率低，溶劑量多也給濃縮帶來不便。經(jīng)過多次反復(fù)研究，得出最優(yōu)醇提工藝參數(shù)為醇提2次，浸泡時(shí)間1.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，加乙醇量為藥材量的12倍和8倍，醇回流時(shí)間1.5 h和1.0 h；最優(yōu)水提工藝參數(shù)為水提2次，浸泡時(shí)間2 h，水提溫度100℃，加水量為藥材量的15倍和10倍，水提時(shí)間1.5 h和1.0 h。

（3）采用醇提方法主要提取人參、桑葚、玫瑰花中的人參皂苷，水提方法主要提取茯苓、枸杞、山藥多糖，成本較低、操作簡便、提取條件易于控制、且提取效率較高，在工業(yè)化大生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

（4） 采用苯酚-硫酸法測定水提液中多糖的含量誤差較大，是導(dǎo)致正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)意義的主要原因，應(yīng)增加多糖測定的重復(fù)次數(shù)，以重復(fù)試驗(yàn)的誤差作為誤差來源，另外參考課題組的其他多糖提取正交試驗(yàn)推測多糖在提取溫度85℃時(shí)即可充分提取，在100℃提取溫度下提取時(shí)間過長反而會(huì)破壞多糖活性，故也可能導(dǎo)致各因素水平差異不顯著。