陳豫欽 鄺美丹 廖靜 盧文菊 王健

呼吸疾病國家重點實驗室 國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 廣東省血管疾病重點實驗室 廣州呼吸健康研究院 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科

肺動脈高壓 (pulmonary hypertension，PH)是一種進(jìn)行性的致死性疾病，可導(dǎo)致肺血管阻力和肺動脈壓力的進(jìn)行性升高，從而發(fā)展為右心室肥厚、心力衰竭甚至死亡[1]。最新的流行病學(xué)數(shù)據(jù)估計，PH患病率約為全球人口的1%，65歲以上人群PH的患病率高達(dá)10%[2]。已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人民群眾健康的一大類疾病。加強(qiáng)PH發(fā)病機(jī)制研究、推進(jìn)新型藥物研發(fā)是提高PH防治水平的必經(jīng)之路。因此，建立穩(wěn)定、可重復(fù)、與人類疾病發(fā)病機(jī)制及病理生理學(xué)特征相似且制作簡單的動物模型是研究PH的基礎(chǔ)?，F(xiàn)將國內(nèi)外制作PH模型的方法進(jìn)行綜述，以便研究者根據(jù)研究目的選擇適合的動物模型。

1 PH動物模型的分類

按照造模方法分類可分為自發(fā)性PH模型和非自發(fā)性肺動脈模型。目前自發(fā)性PH模型主要是利用基因敲除(gene knock out)和基因嵌入 (gene knock in)技術(shù)獲得相應(yīng)的病理生理變化的轉(zhuǎn)基因動物。而非自發(fā)PH模型則可利用外科手術(shù)、藥物及各種環(huán)境因素制備。按照疾病產(chǎn)生的病理生理學(xué)始發(fā)因素，可以將PH模型分為動力性肺動脈高壓 (hyperkinetic pulmonary hypertension)模型和肺血管阻力性肺動脈高壓 (resistance pulmonary hypertension)模型。前者主要為高肺血流動物模型，以分流手術(shù)和肺葉切除手術(shù)構(gòu)建的PH模型較為常見。后者包括低氧性PH動物模型、栓塞性PH模型、藥物所致PH動物模型等。

2 實驗動物的選擇

目前用于制作PH的動物包括豬[3]、犬[4]、羊[5-6]等大型動物，以及兔[7-8]、大鼠、小鼠等小型動物。大型動物多應(yīng)用于高肺血流動物模型以及栓塞性PH模型的制備。在高肺血流動物模型中，選用大型動物便于手術(shù)操作，且大動物對手術(shù)傷害有較好的耐受性、愈合能力強(qiáng)，與人類疾病的相似程度較高。但大型動物實驗費用昂貴，動物飼養(yǎng)要求高，手術(shù)需要多人協(xié)助，其中最主要的缺點是無法進(jìn)行大規(guī)模重復(fù)實驗。因此，也有研究者采用大鼠制作高肺血流動物模型[9]，此模型對操作者手術(shù)技術(shù)要求高，但大鼠具有抗感染力強(qiáng)、易恢復(fù)的優(yōu)點，適合手術(shù)造模。而栓塞性PH模型的穩(wěn)定性差，制作復(fù)雜，一般使用大型動物的成功率較高。

小型動物中以大小鼠應(yīng)用最為廣泛，優(yōu)點為遺傳背景明確、性狀穩(wěn)定，且實驗成本低，飼養(yǎng)方便，適合大規(guī)模研究。例如野百合堿 (monocrotaline，MCT)致PH模型和低氧性PH模型多采用大小鼠進(jìn)行制備。而轉(zhuǎn)基因動物研究的模型多以小鼠為主，這與小鼠繁殖力強(qiáng)、轉(zhuǎn)基因成功率高有關(guān)。因此，在制備PH模型時應(yīng)綜合考慮研究成本、可操作性及動物的耐受程度，選擇合適的動物種類。出于動物福利及研究的重復(fù)性，建議盡可能選用小型動物。另外，目前研究者多選用雄性動物制備PH模型，特別是低氧性PH模型，這與雌性動物對低氧具有較好耐受性有關(guān)。

3 常用的PH動物模型的制備

3.1 自發(fā)性PH模型 主要是利用基因敲除和基因嵌入，使模型動物中某種或多種基因不表達(dá)、低表達(dá)或過表達(dá)，從而自發(fā)PH，用于研究與干預(yù)基因相關(guān)的PH的發(fā)病機(jī)制?；蚯贸煞譃橄到y(tǒng)性基因敲除和條件性基因敲除。系統(tǒng)性基因即對動物體內(nèi)所有的器官組織細(xì)胞中靶基因進(jìn)行敲除，如小窩蛋白 (caveolin-1，cav-1)[10]、內(nèi)皮一氧化氮合酶 (endothelial Nitric oxide synthase，eNOS)[11]及線粒體解偶聯(lián)蛋白 (uncoupling protein 2，UCP-2)[12]基因敲除小鼠可自發(fā)輕到中度PH。條件性基因敲除是使特定組織器官或細(xì)胞中靶基因滅活，如肺內(nèi)皮細(xì)胞BMPR2基因敲除小鼠[13]及內(nèi)皮細(xì)胞的GATA-6基因敲除小鼠[14]可自發(fā)PH。有研究者利用Cre/LoxP技術(shù)得到PHD2在內(nèi)皮細(xì)胞及造血細(xì)胞聯(lián)合敲除的小鼠模型，該模型小鼠可自發(fā)嚴(yán)重的PH，在3.5個月時，右心室收縮壓為60～90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)，并出現(xiàn)新生內(nèi)膜及叢樣病變，病變呈進(jìn)行性加重，80%的模型小鼠在6個月時死亡[15]。另外，基因嵌入是根據(jù)實驗要求，在目的基因位置引進(jìn)特定的突變或外源基因。如Chu等[16]通過給大鼠血液注射腺相關(guān)病毒攜帶血管生成素1的過表達(dá)載體 (adeno-associated virus-angiopoietin-1，AAV-Ang-1)使血管生成素1過表達(dá)，60 d后造成PH。5-羥色胺轉(zhuǎn)運體 (5-Hydroxytryptamine Transporter，5HTT)[17]及IL-6[18]的過表達(dá)模型小鼠也可自發(fā)PH。

3.2 MCT致PH動物模型 是目前應(yīng)用最為廣泛的PH動物模型，該方法的優(yōu)點為造模簡單，成功率高，重復(fù)性好。缺點為動物死亡率高，與人類疾病發(fā)病機(jī)制差異較大。MCT致PH動物模型常出現(xiàn)ALI[19-21]、間質(zhì)性肺纖維化[22-23]、壞死性肺動脈炎[24-25]、心肌炎[26-28]、肝毒性[29-30]等嚴(yán)重并發(fā)癥。造模時MCT劑量為45～60 mg/kg體質(zhì)量[31-33]，皮下或腹腔注射1次，21～30 d后即可造模成功。該模型的病理改變?yōu)榉窝芷交用黠@增生，并伴有血管內(nèi)膜增厚，這與其他PH動物模型及臨床上PH患者病理改變不符。MCT導(dǎo)致PH的具體分子機(jī)制尚不明確，其引起肺血管重塑是由MCT介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷刺激肺動脈平滑肌細(xì)胞增生還是間質(zhì)細(xì)胞肌化造成的還沒有定論[21]。Xiao等[34]發(fā)現(xiàn)MCT可以直接激活鈣敏感受體 (calciumsensing receptor，CaSR)，造成肺動脈內(nèi)皮損傷，進(jìn)而導(dǎo)致PH。還有研究報道MCT可以造成骨形成蛋白受體Ⅱ(bone morphogenetic protein receptor，BMPRⅡ)功能障礙和BMP信號中斷[35]、引起NO信號通路障礙[36]、以及明確的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損害[24，37]，這些都可能是其造成PH的部分分子機(jī)制。

3.3 低氧性PH模型 慢性低氧是引起PH的重要因素之一[38]。低氧性PH模型是進(jìn)行第3類PH相關(guān)研究的首選模型，其優(yōu)點為制作方便，重復(fù)性好，模型成活率高，適合小型動物造模，與臨床疾病發(fā)病機(jī)制相似程度高。高原病及睡眠呼吸相關(guān)的PH采用該模型也具有較好的相似性。但是制作該模型需要專業(yè)的儀器設(shè)備，制作成本高。低氧性PH模型可分為常壓低氧模型和低壓低氧模型。制作方法多為低氧動物飼養(yǎng)箱10%氧濃度飼養(yǎng)動物14～21 d[39]。研究者多采用自制的簡易缺氧箱，在模型制備過程中應(yīng)注意避免箱體內(nèi)高CO2，保證動物飼養(yǎng)環(huán)境。目前已有全自動的缺氧動物模型飼養(yǎng)箱研制成功，應(yīng)用方便靈活，性能穩(wěn)定，造模成功率較高。造模2～3周后動物肺動脈可出現(xiàn)病理改變，即顯著的血管重塑及右心肥厚，動物體質(zhì)量增長遲緩，并伴有肺部炎癥細(xì)胞浸潤[40]。低氧性PH模型可以模擬第3類PH患者低氧性血管收縮、炎癥等改變，但無法模擬充氣過度的機(jī)械刺激、毛細(xì)血管缺失、吸煙的毒性損傷等病理改變。

3.4 肺高血流模型 本模型是通過外科手術(shù)方法引起肺血流量的相對或絕對增加，從而造成肺動脈壓力增高，與臨床上部分先天性心臟病引起的PH以及部分栓塞性PH具有相似性。但是該類動物模型肺動脈壓升高都不是很明顯，且模型不穩(wěn)定，動物死亡率高，只適用于大型動物。該模型制作方法多種多樣，但都涉及復(fù)雜的外科手術(shù)，動物損傷大，并需要使用呼吸機(jī)，可以制作可逆性的PH模型。手術(shù)方法包括單側(cè)肺動脈結(jié)扎[9]、頸動脈-肺動脈分流[7]、主動脈-肺動脈分流[41]、鎖骨下動脈-主肺動脈吻合術(shù)[42]、胸主動脈-左肺動脈吻合術(shù)[43]等。該類模型的制作，動物的麻醉是手術(shù)成功的關(guān)鍵因素，目前常用的麻醉方法為氯胺酮與一種肌松藥聯(lián)用，術(shù)中根據(jù)動物體征變化給予維持劑量。先天性室間隔缺損的Yucatan小型豬繼發(fā)PH模型也屬于高肺血流模型的一種[44]。

3.5 嚴(yán)重PH模型 PH患者在臨床上呈現(xiàn)難治性、進(jìn)行性惡化的特征。大部分患者初診時已經(jīng)到達(dá)了嚴(yán)重階段，很難用藥物控制病情。因此，建立嚴(yán)重PH模型，對嚴(yán)重PH的發(fā)病機(jī)制及靶向藥物的研究具有重要意義。嚴(yán)重PH模型應(yīng)滿足以下三個條件：一是肺動脈收縮壓或右心室收縮壓≥60 mm Hg；二是肺血管出現(xiàn)新生內(nèi)膜或叢樣病變；三是脫離刺激 (如低氧)后，病理改變不發(fā)生逆轉(zhuǎn)。嚴(yán)重PH模型通常是采用 “雙重打擊”的方法建立，如低氧聯(lián)合內(nèi)皮生長因子受體 (vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)抑制劑Sugen(SU5416)誘導(dǎo)的PH模型[45-47]、MCT聯(lián)合內(nèi)皮素受體B(endothelin Breceptor，ETBR)敲除模型[48]、低氧聯(lián)合ETBR敲除模型[49]、低壓低氧 (或低氧)聯(lián)合MCT模型[50-51]、MCT聯(lián)合左肺切除術(shù)模型[52]及Sugen聯(lián)合左肺切除術(shù)模型[53]等。目前最常用的嚴(yán)重PH模型是Sugen聯(lián)合缺氧誘導(dǎo)的PH(sugen hypoxia induced-pulmonary hypertension，Su Hx-PH)，該模型由于其病程與病理改變與嚴(yán)重PH患者具有較高相似性，主要用于第1類嚴(yán)重PH的相關(guān)研究。其制作方法為一次性皮下注射Sugen后，在10%氧濃度的環(huán)境下飼養(yǎng)3周，再置于常氧下數(shù)周 (1～11周)。模型鼠隨著造模時間的延長，病變愈加嚴(yán)重，其肺血管內(nèi)膜逐漸增厚，13～14周后，可出現(xiàn)叢樣病變，肺循環(huán)阻力逐漸增加，心指數(shù)持續(xù)下降[45-47]。但是不同品系的大鼠，甚至是不同亞系的大鼠對sugen的反應(yīng)有差異，通常采用SD(Sprague-Dawley)大鼠進(jìn)行該模型的制備[54]。嚴(yán)重PH的小鼠模型目前尚存爭議。

3.6 栓塞性PH模型 該模型與臨床上第4型PH相似度高。根據(jù)栓子來源又可分為自體栓子栓塞法和異體栓子栓塞法，自體栓子多為動物自身血栓[55]，異體栓子包括乳膠微粒栓[56]、異體血栓、瓷栓[4]、氣栓[5]、葡聚糖凝膠栓子[6]、氣囊栓塞[57]等。該模型制作缺點為模型穩(wěn)定性差，評價困難，制作復(fù)雜，需使用大型動物進(jìn)行制作，且無法模擬臨床上該類患者整體的血流動力學(xué)改變及血栓處理后的病理生理改變 (其中包括影響患者術(shù)后生存的肺組織缺血再灌注損傷)，大大限制了該類模型的應(yīng)用。應(yīng)用介入技術(shù)進(jìn)行定位栓塞將成為該類模型未來制作的方向。

3.7 急性PH模型 多使用藥物或者改變環(huán)境因素使模型動物在短時間內(nèi)出現(xiàn)PH，一般停用藥物或者脫離環(huán)境因素后便可恢復(fù)正常。此類模型能即時、直觀的反應(yīng)藥物或者環(huán)境因素對肺動脈壓力的影響，多應(yīng)用于評價藥物急性的舒血管作用及血流動力學(xué)急性改變的機(jī)制研究。最初主要選用大型動物如羊、豬用于模型制作，近年來越來越多的研究者用大鼠制備穩(wěn)定的PH急性模型。目前急性PH模型主要是通過持續(xù)靜脈注射前列腺素H2/血栓素A2受體激動劑U46619，動態(tài)監(jiān)測肺動脈壓力，使平均肺動脈壓力穩(wěn)定維持在一定高壓范圍內(nèi)[58]。由于藥物反應(yīng)性不同，維持用藥量在不同種屬以及同一種屬的不同個體的之間存在差異，因此實驗前需要摸索給藥濃度及劑量，使平均肺動脈壓力能維持在一個穩(wěn)定的范圍至少30 min。一般1.0～2.0μg·kg-1·min-1[59]的給藥速率可使羊的平均肺動脈壓維持在25～30 mm Hg，另外有研究者用 (1.1±0.1)μg·kg-1·min-1的給藥速率能使羊的平均肺動脈壓達(dá)到35 mm Hg[60]。應(yīng)用豬制備模型時可使用0.6～0.8μg·kg-1·min-1較小給藥速率靜脈注射U46619，其平均肺動脈壓則可穩(wěn)定在40 mm Hg左右達(dá)3 h[61]。而小型動物如大鼠給藥速率維持在830～1 125 ng·kg-1·min-1[58]也可使平均肺動脈壓維持在25～30 mm Hg。

PH因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，因此造成PH動物模型制作方法眾多，方法差異大，選用造模動物種類較多，但針對不同類型的PH已建立了與人類疾病具有較高相似度且比較穩(wěn)定的動物模型。但各種造模方法都有其自身的優(yōu)勢和局限，已在上文中做了具體的論述?，F(xiàn)在最成熟、最常用的PH動物模型為MCT致PH模型、低氧性PH動物模型和Su Hx-PH模型，但MCT致PH動物模型和低氧性PH動物模型無法完全模擬人類疾病的病理生理學(xué)改變，應(yīng)該在研究中引起注意。肺高血流模型及栓塞性PH動物模型目前缺乏成熟的造模方法，無論外科手術(shù)或介入方法都存在動物損傷大、死亡率高、模型評價困難等問題。隨著小動物影像評價技術(shù)的進(jìn)步，通過介入技術(shù)進(jìn)行微創(chuàng)定位栓塞或手術(shù)，將成為該類模型制作的趨勢。基因編輯制備的自發(fā)性PH模型是研究PH發(fā)病機(jī)制的有效研究工具。除急性PH模型之外，PH動物模型的制作一般造模時間較長，涉及復(fù)雜外科手術(shù)及大型動物，并且存在模型制作及模型評價對動物造成重復(fù)傷害。因此在模型制作過程中應(yīng)充分考慮動物福利，嚴(yán)格遵循實驗動物福利Reduction(減少)、Replacement(替代)、Refinement(優(yōu)化) “3R”原則，在此提出動物模型制作三點倡議：(1)盡可能選用小型動物，減少動物實驗數(shù)量；(2)在滿足實驗要求的前提下減少造模時間，減輕造模過程中動物的痛苦；(3)充分參考其他研究者的造模經(jīng)驗。綜上所述，PH動物模型的制備應(yīng)當(dāng)在具體的研究工作中根據(jù)研究目的、研究條件選用適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ?。利用新技術(shù)、新儀器建立更符合人類疾病發(fā)生發(fā)展的模型是未來動物模型制作的發(fā)展趨勢。