熊琳 何曉琴 范黎 徐細(xì)明

[摘要] 目的 探討MK-2206作用于肝癌細(xì)胞huh7后對(duì)其生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系huh7，采用不同濃度（0、2.5、5、10、20、40 μmol/L）MK-2206干預(yù)huh7細(xì)胞。采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化;蛋白免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 與對(duì)照組（0 μmol/L）比較，MK-2206對(duì)肝癌細(xì)胞huh7的增殖活性有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性（P < 0.05）;MK-2206誘導(dǎo)huh7細(xì)胞凋亡（P < 0.05），顯著抑制Akt的蛋白表達(dá)（P < 0.05）。 結(jié)論 Akt抑制劑MK-2206可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)控肝癌細(xì)胞huh7的生物學(xué)行為。

[關(guān)鍵詞] 肝癌;PI3K/Akt信號(hào)通路;MK-2206;增殖;遷移;凋亡

[中圖分類號(hào)] R735.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）01（a）-0008-05

肝癌是世界第六大常見(jiàn)癌癥，也是發(fā)生癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，近年來(lái)其發(fā)病率及死亡率仍呈上升趨勢(shì)[1]。我國(guó)肝癌患者人數(shù)占全世界肝癌患者的55%[2]。手術(shù)切除是肝癌的首選治療方法，但肝癌發(fā)病隱匿，惡性程度高，進(jìn)展速度快，根治性手術(shù)僅可用于不足30%的患者[3]。因此，系統(tǒng)性治療在中晚期肝癌患者的治療中扮演著重要角色。傳統(tǒng)的化療方法副作用大，療效不佳，易耐藥[4]。分子靶向藥物索拉非尼可改善中晚期肝癌患者生存期，但其僅可延長(zhǎng)總體生存期數(shù)月[5-6]。目前，迫切需要開(kāi)發(fā)出新的靶向治療藥物。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要靶點(diǎn)，該通路在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及自噬等方面中具有重要作用[7]，有望成為新的惡性腫瘤治療靶點(diǎn)。MK-2206是一種人工合成的Akt特異性變構(gòu)抑制劑，可有效抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有良好的抗腫瘤活性[8-9]。本研究以肝癌細(xì)胞huh7為研究對(duì)象，探討MK-2206的抗肝癌作用及其可能的作用機(jī)制，以期為其抗腫瘤研究和臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器? 超凈工作臺(tái)（美國(guó)AIRTECH）;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder）;普通及倒置顯微鏡（日本Olympus）;離心機(jī)（德國(guó)Thermo）;流式細(xì)胞儀（美國(guó)Bio-Rad）;酶標(biāo)儀（美國(guó)PerKin Elmer）;超低溫冰箱（New Brunswick Scientific）、電熱恒溫干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）;SDS-PAGE電泳（北京六一生物科技有限公司）;Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR）等。

1.1.2 試劑? DMEM（美國(guó)Gibco公司）;胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）;青鏈霉素（美國(guó)Hyclone）;胰蛋白酶-EDTA（美國(guó)Hyclone）;胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone），MK-2206（selleck公司）;CCK-8試劑（日本Dojindo）;細(xì)胞凋亡試劑盒（美國(guó)Bio-rad）;BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Sigma）;蛋白上樣緩沖液（日本Takara）;蛋白Marker（日本Takara）;蛋白抗體（美國(guó)Abcam）等。

1.1.3 細(xì)胞系? 人肝癌細(xì)胞huh7細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代? 將huh7細(xì)胞接種于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每2 d為細(xì)胞更換培養(yǎng)液1次。于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到覆蓋瓶底70%～80%面積時(shí)，可進(jìn)行傳代接種。棄瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，用1 mL胰酶均勻覆蓋瓶底，在培養(yǎng)箱孵育1～2 min，待細(xì)胞收縮變圓，用培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清，按1∶3傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率檢測(cè)? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的huh7細(xì)胞，0.5%胰酶消化1 min后，RT 1000 g/min離心5 min，重懸培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，接種于3塊96孔板，每孔加入上述細(xì)胞懸液100 μL。待細(xì)胞貼壁后加入MK-2206，使藥物終濃度分別為2.5、5、10、20和40 μmol/L，每種濃度組以及陰性對(duì)照組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別在加藥后24、48、72 h后加入CCK-8（10 mg/mL）10 μL，于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min～1 h，以490 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀讀取吸光度，取5個(gè)復(fù)孔的平均值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率=1-（OD加藥孔-OD調(diào)零孔）/（OD對(duì)照孔-OD調(diào)零孔）。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率? 收集不同藥物濃度（0、2.5、5、10、20和40 μmol/L）處理24 h后的huh7細(xì)胞，收集原培養(yǎng)基，用0.5%不含EDTA的胰蛋白酶0.5 mL消化各孔，30 s～1 min后終止消化，將原培養(yǎng)基和消化液一同離心，RF 2000 g/min離心5 min。其后，棄上清，用2 mL 4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）懸浮細(xì)胞，2000 g/min，離心5 min。重復(fù)上述步驟一次，棄PBS，加入100 μL Binding buffer，加入5 μL異硫氰酸熒光素（FITC），渦旋混勻后，加入10 μL碘化丙啶（PI），室溫避光孵育5 min，再補(bǔ)充加入400 μL Binding buffer后上機(jī)檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞總凋亡率=早期凋亡率（Annexin+/PI-）+晚期凋亡率（Annexin+/PI+）。

1.2.4 Western blot測(cè)蛋白表達(dá)量差異? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期huh7細(xì)胞，接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁24 h后，用不同藥物濃度（0、2.5、5、10、20和40 μmol /L）處理24 h。加入 4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液100 μL后，冰上作用30 min。用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞碎片和裂解產(chǎn)物，移入1.5 mL離心管。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎上述產(chǎn)物后，4℃ 12 000 g/min高速冷凍離心20 min。BCA檢測(cè)法檢測(cè)蛋白濃度，用細(xì)胞裂解緩沖液調(diào)整各組間的蛋白濃度，使其一致，加入上樣緩沖液，100℃加熱5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）凝膠電泳，將分離后蛋白電泳轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜3次后分別加入一抗（Akt、p-Akt、β-catenin及GAPDH）4℃搖床過(guò)夜孵育12 h，而后洗膜3次，加入二抗于搖床作用1 h，再次洗膜3次，于Odyssey上掃膜，并計(jì)算灰度值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。相對(duì)灰度值=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較用秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用成組χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MK-2206對(duì)huh7的生長(zhǎng)抑制作用

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度MK-2206處理huh7細(xì)胞24、48、72 h后均能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，且抑制效應(yīng)呈時(shí)間和濃度依賴性。MK-2206的24、48、72 h的半抑制濃度（IC50）分別為5.467、2.961、1.924 μmol/L。當(dāng)藥物濃度達(dá)到40 μmol/L時(shí)，在不同藥物作用時(shí)間下均可使huh7幾乎全數(shù)死亡。見(jiàn)圖1。

2.2 MK-2206對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

取MK-2206濃度0、2.5、5、10、20和40 μmol/L，作用huh7細(xì)胞24 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，除外2.5 μmol/L，與空白對(duì)照組（0 μmol/L）比較，其余各濃度組的凋亡率明顯升高，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2、表1。當(dāng)藥物濃度達(dá)到40 μmol/L時(shí)，鏡下觀察，huh7細(xì)胞幾乎全數(shù)死亡，流式圖中呈現(xiàn)單一細(xì)胞團(tuán)。其后增設(shè)濃度組，即取0、2.5、5、10、20、25、30、35和40 μmol/L作用于huh7細(xì)胞24 h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果當(dāng)藥物濃度達(dá)到30 μmol/L，即出現(xiàn)huh7細(xì)胞大量凋亡。見(jiàn)圖2A。

2.3 MK-2206對(duì)Akt/PI3K/mTOR信號(hào)通路的影響

藥物濃度達(dá)40 μmol/L時(shí)，huh7細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，其提取所得蛋白的濃度過(guò)低，無(wú)法顯示出蛋白條帶。Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組（0 μmol/L）比較，Akt蛋白表達(dá)水平隨MK-2206的濃度升高而顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;與空白對(duì)照組比較，p-Akt蛋白水平表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

肝癌的發(fā)生率及死亡率呈上升趨勢(shì)，是我國(guó)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前的治療方式使患者獲益有限，急需探索新的治療方式[10]。PI3K/Akt在多種腫瘤中高表達(dá)，參與腫瘤的惡性進(jìn)展，同時(shí)在肝癌惡性進(jìn)展及化療耐藥中起到重要的作用[11-12]。Akt作為PI3K的下游靶蛋白，是PI3K/Akt信號(hào)通路的核心靶點(diǎn)。因此，通過(guò)調(diào)控Akt表達(dá)可調(diào)整細(xì)胞增殖和凋亡的平衡，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)[13]。MK-2206可促進(jìn)急性髓性白血病細(xì)胞的凋亡，并且增加阿糖胞苷的細(xì)胞毒性[14]。MK-2206可通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。同時(shí)，MK-2206也抑制結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的增殖[16]。在臨床研究中，MK-2206也展示出了良好的治療效果[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，MK-2206可以抑制huh7細(xì)胞的增殖，且抑制效應(yīng)呈濃度和時(shí)間依賴性;MK-2206可以促進(jìn)huh7細(xì)胞的凋亡，且呈濃度依賴性。MK-2206可通過(guò)抑制huh7中的PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究的不足之處：①實(shí)驗(yàn)對(duì)象單一，缺乏體外實(shí)驗(yàn)，后期可以對(duì)具有高侵襲能力的肝癌細(xì)胞系開(kāi)展相關(guān)研究;②本研究只對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行了蛋白表達(dá)水平的驗(yàn)證，缺乏對(duì)這兩條通路的下游靶蛋白表達(dá)水平的驗(yàn)證;③本研究缺少凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的驗(yàn)證。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑MK-2206通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞系huh7的凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。后期可進(jìn)一步完善MK-2206對(duì)肝癌細(xì)胞抗腫瘤作用的研究。

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（收稿日期：2018-06-06? 本文編輯：王? ?蕾）