張錦華 ，臧三麗 ，白寶清 ，岳建偉 ，范三紅

（1.山西大學生命科學學院，山西太原 030006；2.山西眾智檢測科技有限公司，山西太原 030006）

苦味問題一直是柑橘汁加工工業(yè)中亟待解決的關(guān)鍵性難題。有研究表明，檸檬苦素和柚皮苷是在柑橘類果汁生產(chǎn)中產(chǎn)生苦味的主要物質(zhì)[1-4]。其中，檸檬苦素的苦味閾值很低，在水溶液中為1.0 mg/L，在果汁中約為3.4 mg/L，是柚皮苷苦味的20倍，且是引起果汁加工過程中產(chǎn)生后苦味的主要因素[5-6]。因此，研究改善檸檬苦素苦味的方法顯得尤為重要。

檸檬苦素是一種三萜類植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于蕓香科和楝科中[5]，在柑橘屬植物中含量最為豐富，是柑橘加工中產(chǎn)生苦味的主要物質(zhì)[7]。有研究表明，檸檬苦素在柑橘果實中的含量較少，但由于柑橘果實中含有大量的檸檬苦素前體物質(zhì)——非苦味的檸檬苦素A環(huán)內(nèi)酯（LARL）[5，8]，在食品加工過程中采用的酸性、冰凍等條件下，LARL在檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶的催化下迅速轉(zhuǎn)化為具有強烈苦味的檸檬苦素，從而導致柑橘汁產(chǎn)生后苦或延遲苦味的現(xiàn)象[4，9-12]。因此，降低加工后柑橘類果汁中的檸檬苦素含量是解決苦味現(xiàn)象的重要前提。

目前，脫除檸檬苦素等苦味物質(zhì)的方法主要分為物理法和生物法，其中，物理脫苦法主要包括吸附脫苦、膜分離脫苦、超臨界CO2脫苦、屏蔽法脫苦和添加苦味抑制劑脫苦等；生物脫苦法主要是通過酶或微生物來降解柑橘果汁苦味成分，從而達到脫苦的目的，主要包括酶法脫苦、固定化細胞脫苦和基因工程脫苦等[13-19]，酶法脫苦具有專一性強、效果好、風味和營養(yǎng)成分無破壞、成本低等優(yōu)點，是目前主要的研究趨勢[20]。文獻報道中相關(guān)的脫苦酶主要有檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶、檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯脫氫酶、檸檬苦素環(huán)氧酶、檸檬苦素醇脫氫酶等[21-24]，這些酶可以將檸檬苦素轉(zhuǎn)化為檸檬苦醇、檸檬苦酸和17-脫氫檸檬苦素類A-環(huán)內(nèi)酯[25-26]。但上述這些酶最適的作用條件均為堿性，在酸性環(huán)境中的活性降低，而在實際應用中常因果汁的低pH值而使酶失活，且生產(chǎn)成本高，不適合工業(yè)化需求。

為提供并豐富實際果汁加工過程中優(yōu)質(zhì)高效的脫苦酶來源，從生物脫苦的角度出發(fā)，前期試驗從酸性的釀醋醋醅中篩選得到1株高效降解檸檬苦素的微生物菌株解鳥氨酸拉烏爾菌C6（Raoultella ornithinolytica），本研究對C6的降解特性及條件進行了研究，并對其分泌的檸檬苦素降解酶進行了分離純化，以期為該菌及其酶系在柑橘汁的脫苦應用提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株為檸檬苦素降解菌株解鳥氨酸拉烏爾菌 C6（Raoultella ornithinolytica），保存于山西大學生命科學學院微生物實驗室。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

1.2.1 試劑和培養(yǎng)基 檸檬苦素標準品（純度≥98%）購自上海金穗生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

無機鹽液體培養(yǎng)基：MgSO45 g，K2HPO410 g，KCl 5 g，KNO33 g，NaCl 2 g，檸檬苦素 6 mg，酵母膏1 g，蒸餾水 1 000 mL，以 HCl調(diào) pH 值為 4.0（檸檬苦素質(zhì)量濃度為6 mg/L）。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值自然（液體培養(yǎng)基中不加瓊脂）。

酶反應溶液：MgSO45 g，K2HPO410 g，KCl 5 g，KNO33 g，NaCl 2 g，檸檬苦素 6 mg，溶解于 1 000 mL的pH值為4.0的檸檬酸緩沖液中。

染色液（1 L）：1.0 g考馬斯亮藍 G-250，250 mL異丙醇，100 mL冰醋酸，650 mL蒸餾水。

脫色液（1 L）：50 mL乙醇，100 mL冰醋酸，850 mL蒸餾水。

1.2.2 儀器設(shè)備 SW-CJ-2FD型潔凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；HRHPY-300恒溫培養(yǎng)搖床，青島海爾特種電冰柜有限公司；HRSP-250H生化培養(yǎng)箱，青島海爾特種電冰柜有限公司；BL-75型立式壓力蒸汽滅菌筒，上海東亞壓力容器制造有限公司；JA1203N電子天平，上海精密科學儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-III型循環(huán)水真空泵，上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司；UV-2800型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；GZX-9023MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SB25-12DTDN型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；離子交換層析柱（2.6 cm×20 cm）、凝膠過濾層析柱（1.6 cm×50 cm）、透析袋（截留分子量6～14 ku），上海華美生物公司；GIS-2009電泳凝膠成像系統(tǒng)，天能科技上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 解鳥氨酸拉烏爾菌C6對檸檬苦素降解特性

1.3.1.1 解鳥氨酸拉烏爾菌C6的生長曲線 挑取一環(huán)單菌落接入50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)12 h，制得種子液。將種子液以1%的接種量接入50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，在600 nm處測定菌液的光密度值（OD600），繪制菌株生長曲線。

1.3.1.2 檸檬苦素降解曲線 將種子液以1%的接種量接入50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，在600nm處測定菌液的光密度值（OD600），繪制菌株生長曲線，并測定培養(yǎng)基中檸檬苦素的含量，以不接菌的液體培養(yǎng)基為空白對照，計算解鳥氨酸拉烏爾菌C6對檸檬苦素的降解率，繪制降解曲線。

1.3.2 解鳥氨酸拉烏爾菌C6對檸檬苦素降解條件優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗 將解鳥氨酸拉烏爾菌C6的種子液以1%的接種量分別接種到50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，考察種子液菌齡、底物檸檬苦素質(zhì)量濃度、接種量和培養(yǎng)時間對檸檬苦素降解率的影響。

1.3.2.1.1 種子液菌齡對檸檬苦素降解率的影響檸檬苦素質(zhì)量濃度6 mg/L，接種量1%，培養(yǎng)時間10 h，測定種子液菌齡為 6，8，10，12，14 h 時解鳥氨酸拉烏爾菌C6的檸檬苦素降解率。

1.3.2.1.2 檸檬苦素質(zhì)量濃度對檸檬苦素降解率的影響 菌齡10 h，接種量1%，培養(yǎng)時間10 h，測定底物檸檬苦素質(zhì)量濃度為 2，4，6，8，10 mg/L時解鳥氨酸拉烏爾菌C6的檸檬苦素降解率。

1.3.2.1.3 接種量對檸檬苦素降解率的影響 菌齡10h，底物檸檬苦素質(zhì)量濃度6 mg/L，培養(yǎng)時間10 h，測定接種量為0.2%，0.6%，1.0%，1.4%，1.8%時解鳥氨酸拉烏爾菌C6的檸檬苦素降解率。

1.3.2.1.4 培養(yǎng)時間對檸檬苦素降解率的影響 固定菌齡10 h，接種量1%，底物檸檬苦素質(zhì)量濃度6 mg/L，測定培養(yǎng)時間為 6，8，10，12，14 h 時解鳥氨酸拉烏爾菌C6的檸檬苦素降解率。

每組試驗重復3次，取平均值。

1.3.2.2 響應面優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，分別對每個因素選取低、中、高3個水平，利用試驗設(shè)計軟件Design-expert 8.06中的Box-Behnken設(shè)計方案，以解鳥氨酸拉烏爾菌C6對檸檬苦素降解率為響應值，采用4因素3水平的響應面分析法對降解條件進一步優(yōu)化。響應面試驗因素水平列于表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

1.3.3 優(yōu)化條件下解鳥氨酸拉烏爾菌C6的降解速率 在最優(yōu)條件下，對不同培養(yǎng)時間下解鳥氨酸拉烏爾菌C6的檸檬苦素降解量進行測定，并計算檸檬苦素降解率。

1.3.4 檸檬苦素降解酶的分離純化

1.3.4.1 檸檬苦素降解酶粗酶液的提取 前期試驗表明，具有降解檸檬苦素活力的活性酶主要集中在發(fā)酵上清液中，屬于胞外酶，粗酶液的提取參考文獻[25]并略作改動：將菌株C6的種子液按1%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)物經(jīng)3 500 r/min離心10 min除去菌體。取上清液加入硫酸銨至飽和度為80%，4℃靜置過夜，10 000 r/min離心10 min分離沉淀蛋白，收集沉淀物，用pH值4.0的檸檬酸緩沖液沖洗2次后，溶解并定容至5mL，即為制得的檸檬苦素降解酶粗酶液，采用考馬斯亮藍法測定其蛋白含量。

1.3.4.2 硫酸銨飽和度的確定 取離心后菌株的發(fā)酵上清液，在冰浴環(huán)境下，邊攪拌邊緩慢加入飽和度不相同的固體硫酸銨（10%～90%，每10%為一間隔），4℃過夜沉淀后，10 000 r/min離心 15 min，將沉淀用少量蒸餾水溶解，放置于透析袋中進行透析除鹽。分別測定各不同飽和度下的檸檬苦素降解酶活力和蛋白量，并繪制出硫酸銨沉淀曲線以確定硫酸銨沉淀的最適飽和度。

將發(fā)酵上清液以最適的硫酸銨飽和度沉淀后鹽析，4℃靜置過夜，10 000 r/min離心30 min，剔除上清液，將沉淀用少量蒸餾水溶解，放置于透析袋中充分透析除鹽24 h（中間每隔4 h換一次透析液），聚乙二醇濃縮后即可得到經(jīng)過初步純化的粗酶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.3 Sephadex G-100凝膠過濾層析 Sephadex G-100凝膠柱（1.6 cm×50 cm）裝柱后，首先用0.02 mol/L，pH值為4.0的檸檬酸緩沖液平衡，然后把經(jīng)過硫酸銨沉淀、透析脫鹽、濃縮后的粗酶液5 mL加到已平衡過的凝膠柱中，并用0.02 mol/L，pH值為4.0的檸檬酸緩沖液洗脫，流速為1 mL/min，用自動部分收集器每5 mL收集一管，采用紫外檢測儀于280 nm波長處進行檢測，跟蹤監(jiān)測蛋白質(zhì)含量；根據(jù)洗脫曲線，收集每個洗脫峰，測定降解檸檬苦素的活性，確定具有降解檸檬苦素酶活性的目標峰并收集，合并后于4℃透析，用聚乙二醇濃縮至5 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.4 DEAE-纖維素離子交換層析 DEAE-纖維素離子交換柱（2.6 cm×20 cm）裝好后，預先用0.02 mol/L，pH值為4.0的檸檬酸緩沖液平衡，然后將經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱收集的活性峰濃縮后的樣品上樣（上樣量為1 mL），先用緩沖液洗脫至樣品完全吸附（洗滌未結(jié)合的雜蛋白至記錄儀顯示無蛋白隨平衡緩沖液流出），再用0～1 mol/L的NaCl溶液（緩沖液配制）進行線性梯度洗脫，流速為2 mL/min。利用自動部分收集器每5 mL收集一管，于280 nm波長處采用紫外檢測儀進行檢測，跟蹤監(jiān)測蛋白含量；根據(jù)洗脫曲線分別收集每個洗脫峰，測定并收集具有降解檸檬苦素活性的目標峰，合并后于4℃透析，濃縮，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.5 降解檸檬苦素酶純度鑒定及分子質(zhì)量測定

采用SDS-PAGE垂直板電泳法[27]鑒定通過多步分離純化后的蛋白酶的純度并測定其相對分子質(zhì)量。SDS-PAGE垂直板電泳采用分離膠質(zhì)量分數(shù)為12%、電流強度為15 mA，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%、電流強度為10 mA。電泳于3 h后停止，采用考馬斯亮藍G-250染色，脫色后拍照。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 檸檬苦素的含量測定 以高氯酸∶冰醋酸體積比為4∶5制得酸母液，取酸母液30 mL，加入1.11 g對二甲胺基苯甲醛，制得DMAB指示劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

準確吸取質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的檸檬苦素標準溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL于試管中，分別加甲醇（色譜純）至2.0 mL，再快速加入3 mL DMAB指示劑和3 mL酸母液，室溫放置30 min后，于470 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、檸檬苦素標準液的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制檸檬苦素標準曲線。并求得回歸方程為y＝0.009 4x＋0.032 5（R2＝0.998 7），檸檬苦素質(zhì)量濃度在0～0.20 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

將培養(yǎng)后的反應體系經(jīng)丙酮超聲提取后旋蒸至干，用10 mL甲醇定容。從中吸取2 mL樣液，快速加入3 mLDMAB指示劑和3 mL酸母液，室溫放置30 min后，以未接入菌種的無機鹽液體培養(yǎng)基作參比，在470 nm處測吸光度，依標準曲線求檸檬苦素的含量[25]；并按公式（1）計算檸檬苦素降解率。

式中，m1為對照中的檸檬苦素含量；m2為降解后樣品中殘余檸檬苦素含量。

1.4.2 檸檬苦素降解酶酶活力測定[25-26]取4支10 mL的EP管，設(shè)定1支對照管及3支測定管。每管加入1 mL酶反應溶液，然后各測定管加入1 mL待測酶液，對照管中加1 mL蒸餾水，反應10 min。將測定管和對照管分別沸水浴15 min以終止酶反應。冷卻后，用甲醇定容至10 mL，從中吸取2 mL樣液，分別快速加入3 mL DMAB指示劑和3 mL酸母液，室溫放置30 min后，在470 nm處測定吸光度，并根據(jù)檸檬苦素標準曲線求出4支EP管中檸檬苦素含量。每毫升酶液在酶反應條件下每分鐘所降解的檸檬苦素的微克數(shù)為一個酶活力單位。酶比活力是指在不同的影響因素下，各水平酶活力與最高酶活力的比值[28]。

式中，N為稀釋倍數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行分析，并用Origin Pro軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解特性研究

圖1表示檸檬苦素降解菌C6在以檸檬苦素為唯一底物的培養(yǎng)基中生長和降解檸檬苦素的情況。由圖1可知，0～2 h為該菌株的生長延滯期，從2 h開始進入對數(shù)生長期，12 h之后進入穩(wěn)定期。隨著菌株的生長，菌株對底物檸檬苦素的降解率也逐漸增加，在2～12 h內(nèi)檸檬苦素降解能力明顯增加，后期趨于穩(wěn)定，且菌株的檸檬苦素降解曲線與其生長曲線的增長趨勢保持一致，推測該菌株的檸檬苦素降解能力可能與其生長量有關(guān)，即隨著生長量的增加其降解檸檬苦素的能力也逐漸增加，降解菌C6發(fā)揮作用的酶系可能為組成酶。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 種子液菌齡對檸檬苦素降解率的影響 從圖2可以看出，種子液菌齡對菌株C6的檸檬苦素降解能力有較大的影響，隨著菌齡的增加，菌株的檸檬苦素降解率也逐漸增加，當菌齡為8 h時，培養(yǎng)后菌株的檸檬苦素降解率達70%以上；當菌齡為10 h時，降解效果最佳，降解率為74.25%；此后降解率隨菌齡的延長而降低。因此，選擇的最佳菌齡為10 h，以達到最佳的效果，加快生物降解速率。

2.2.2 接種量對檸檬苦素降解率的影響 接種量的大小決定發(fā)酵過程中微生物的增長速度，適宜的接種量可以縮短發(fā)酵周期[29]。接種量對菌株C6降解檸檬苦素的影響如圖3所示，隨著接種量的增加，C6的檸檬苦素降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當接種量為1%時，相應菌株的檸檬苦素降解率最高，達到83.47%，說明在該接種量下,菌株對檸檬苦素的利用效率最高；當接種量超過1%時，檸檬苦素降解率逐漸降低。故選擇的最佳接種量為1%。

2.2.3 底物檸檬苦素質(zhì)量濃度對檸檬苦素降解率的影響 檸檬苦素質(zhì)量濃度對菌株降解檸檬苦素的影響如圖4所示，隨著底物檸檬苦素質(zhì)量濃度的增加，檸檬苦素降解率先升高后降低，在檸檬苦素質(zhì)量濃度為0～4 mg/L時，檸檬苦素降解率呈現(xiàn)升高趨勢；在底物檸檬苦素添加量為4 mg/L時體系中菌株的降解率達到最大（85.26%）；當?shù)孜餀幟士嗨刭|(zhì)量濃度超過4 mg/L時，菌體的降解能力反而減弱，可能是由于高質(zhì)量濃度的底物對菌體的生長和作用起到一定的抑制作用。故選擇的最佳檸檬苦素質(zhì)量濃度為4 mg/L。

2.2.4 菌種培養(yǎng)時間對檸檬苦素降解率的影響微生物的發(fā)酵都有其特定的發(fā)酵周期，發(fā)酵時間短不利于菌株中相應作用酶的合成，發(fā)酵時間過長菌體會發(fā)生自溶，同樣不利于發(fā)酵[30]。圖5結(jié)果表明，菌株在培養(yǎng)6 h后檸檬苦素降解率逐漸增加，并達到最佳培養(yǎng)時間段，即在培養(yǎng)12 h時，降解率達到80.61%；之后隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，有毒代謝產(chǎn)物積累，菌體可能發(fā)生自溶或產(chǎn)物的反饋抑制作用，致使降解率逐漸降低。因此，選擇12 h作為最佳培養(yǎng)時間。

2.3 響應面試驗結(jié)果

2.3.1 檸檬苦素降解率的二次多項回歸方程 如表2所示，將菌齡、檸檬苦素質(zhì)量濃度、接種量、培養(yǎng)時間作為研究條件，以檸檬苦素降解率為響應值，共得到29個試驗點，其中27個為析因點，1個為中心點，中心點試驗進行了5次，用來估計誤差。

通過Design-Expert 8.06軟件對表2的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得對檸檬苦素降解率（Y）的二次多項回歸方程為Y＝91.69＋0.18A＋0.64B－0.58C－0.079D－1.11AB－1.32AC－7.5×10-3AD＋1.15BC－0.32BD－0.30CD－2.91A2－1.69B2－2.41C2－1.55D2，對該回歸模型及系數(shù)進行顯著性檢驗，其結(jié)果列于表3。

2.3.2 回歸模型的方差分析 對回歸數(shù)學模型進行方差分析，以檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數(shù)，回歸模型的方差分析如表3所示。通過統(tǒng)計學分析可以發(fā)現(xiàn)，該試驗選用的模型極顯著（P＜0.000 1），方差的失擬項不顯著（P＝0.826 4＞0.05），說明模型的選擇是合適的。另外，模型調(diào)整確定系數(shù)R2Adj為0.806 9，說明模型能解釋80.69%響應值的變化，擬合程度較好。因變量與所考察自變量之間的復相關(guān)系數(shù)R2為0.903 4，說明該模型擬合程度較好，試驗誤差小，可用該回歸方程代替真實點對試驗結(jié)果進行分析。由表3還可知，各因素對檸檬苦素降解率影響程度的大小順序為：檸檬苦素質(zhì)量濃度＞接種量＞菌齡＞培養(yǎng)時間。同時，表3結(jié)果還顯示，在此試驗設(shè)計中，B，C，AB，AC，BC項顯著（P＜0.05），A2，B2，C2，D2項均為極顯著（P＜0.01）。

表2 響應面試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 方差分析

2.3.3 最佳降解條件的確定 根據(jù)回歸模型，得出檸檬苦素降解率取最高值的各因素的優(yōu)化組合為菌齡10.05 h，底物檸檬苦素質(zhì)量濃度4.29 mg/L，接種量0.96%，培養(yǎng)時間12.04 h，在此條件下，檸檬苦素降解率的理論最高值為91.77%?？紤]到實際操作的可行性，將培養(yǎng)條件調(diào)整為菌齡10 h，檸檬苦素質(zhì)量濃度為4 mg/L，接種量1%，培養(yǎng)時間為12 h，在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，結(jié)果表明，菌株C6的檸檬苦素降解率為91.28%±0.17%，與理論值（91.77%）接近，說明該試驗模型可以較好地預測優(yōu)化檸檬苦素降解菌的培養(yǎng)條件，具有實際應用價值。

2.4 最優(yōu)條件下菌株C6的檸檬苦素降解速率分析

試驗進一步考察了菌株C6在優(yōu)化培養(yǎng)條件下12 h內(nèi)降解檸檬苦素的速率（圖6）。由圖6可知，最優(yōu)條件下，將菌齡10 h的菌株以1%的接種量加入到底物檸檬苦素質(zhì)量濃度為4 mg/L的培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)基中檸檬苦素含量的減少量來表征菌株對檸檬苦素的降解速率，相比在培養(yǎng)時間為0～9 h培養(yǎng)基中檸檬苦素含量緩慢降低；培養(yǎng)9～11 h時檸檬苦素含量急劇下降?？梢姡闏6培養(yǎng)9 h后對檸檬苦素的降解能力迅速增加，降解速率也隨著快速增加；11～12 h時降解速率趨于平緩。

2.5 檸檬苦素降解酶的分離純化

2.5.1 硫酸銨飽和度的確定 在發(fā)酵上清液中以不同的硫酸銨飽和度（10%～90%）沉淀粗酶液，測定其透析液的蛋白析出量，作硫酸銨飽和度—蛋白析出量曲線（圖7）。由圖7可知，在40%～80%飽和度范圍內(nèi)，蛋白析出質(zhì)量濃度隨硫酸銨的飽和度的增加而增加；當硫酸銨的飽和度大于80%時，蛋白析出量并沒有顯著增加。因此，選擇飽和度為80%的硫酸銨進行沉淀。

向上清液中加入飽和度為80%的硫酸銨，4℃靜置過夜，收集沉淀，透析，測定透析液的總酶活力為13 194 U，總蛋白質(zhì)量為 217.64 μg（表 4）。

表4 檸檬苦素降解酶純化結(jié)果

2.5.2 Sephadex G-100凝膠過濾柱層析 將通過硫酸銨沉淀、透析脫鹽、濃縮后的蛋白樣品上SephadexG-100凝膠過濾柱，得到如圖8所示的洗脫曲線。

從圖8可以看出，上清液經(jīng)凝膠過濾柱后出現(xiàn)2個明顯的洗脫峰，合并同一峰的洗脫液，濃縮后測定各個峰的蛋白含量和檸檬苦素降解活性，結(jié)果顯示，峰1中蛋白含量為0.02 g/L，降解檸檬苦素酶活力為19.47 U；峰2中蛋白含量為0.013 3 g/L，活性為172.94 U?？梢?，具有降解檸檬苦素能力的活性蛋白主要集中在峰2。

2.5.3 DEAE-纖維素柱層析 峰2濃縮后經(jīng)DEAE-纖維素柱層析分離，對應的洗脫曲線如圖9所示，收集3個洗脫峰，合并后測定相應的蛋白含量和檸檬苦素降解活性，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)主要集中在9～42管，且在第16，37管出現(xiàn)2個活性峰，其中，第16管蛋白質(zhì)含量最高，達到0.925 μg/mL；具有檸檬苦素降解活性的酶主要集中在第7～26管，經(jīng)透析、濃縮后測定檸檬苦素降解酶活力為354.51 U，而35～42管為雜蛋白，不具有檸檬苦素降解活性。

2.5.4 酶純化結(jié)果 發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨鹽析、Sephadex G-100層析、DEAE-纖維素柱層析后，每一個純化步驟后所得到的酶比活力、純化倍數(shù)以及酶活力回收率如表所4所示。

由表4可知，粗酶液在經(jīng)過3步分離純化操作后，酶的純化倍數(shù)為9.44倍，酶活力回收率35.13%，比活力為354.52 U/μg，純化效果明顯。

2.5.5 酶純度鑒定及分子量的測定 對純化后的檸檬苦素降解酶進行SDS-PAGE電泳試驗，結(jié)果如圖10所示，純化后的檸檬苦素降解酶在SDS-PAGE電泳上為單一條帶，達到了電泳純，其相對分子質(zhì)量為27 ku左右。

3 結(jié)論與討論

本試驗對前期從醋醅中篩選出的菌株C6的降解特性進行了研究，明確了其生長量與降解檸檬苦素之間的關(guān)系，對檸檬苦素降解菌的生長周期測定可知，12 h之后進入穩(wěn)定期，生長曲線趨于平衡，其降解曲線與生長曲線總體趨勢保持一致。探討了菌齡、底物檸檬苦素質(zhì)量濃度、接種量、培養(yǎng)時間等單因素對菌株降解檸檬苦素的影響，并在單因素基礎(chǔ)上，應用Box-Benhnken中心組合試驗和響應面分析法，確定了檸檬苦素降解菌的最優(yōu)發(fā)酵條件：菌齡10 h、檸檬苦素質(zhì)量濃度4 mg/L、接種量1%、培養(yǎng)時間12 h，在此條件下，檸檬苦素降解率達到91.28%±0.17%，9 h以后降解速率迅速增加。采用硫酸銨沉淀、透析、濃縮、Sephadex G-100凝膠過濾層析、DEAE-纖維素柱層析對該菌株產(chǎn)生的檸檬苦素降解酶進行逐步純化，得到電泳純的檸檬苦素降解酶（相對分子質(zhì)量為27 ku），純化倍數(shù)為9.44，比活力提高到354.52 U/μg，回收率為35.13%。

試驗填補了酸性環(huán)境中生物脫苦的應用空白，對檸檬苦素降解菌和相關(guān)酶系的特性進行了初步研究，經(jīng)純化得到的檸檬苦素降解酶，其酶活力明顯高于目前文獻報道的D環(huán)內(nèi)酯水解酶、檸酸A-環(huán)內(nèi)酯脫氫酶、檸檬苦素環(huán)氧酶、檸檬苦素醇脫氫酶等的降解活性[21-24，31-35]，并且在酸性環(huán)境中具有顯著的降解優(yōu)勢，后期將對菌株C6檸檬苦素降解酶的作用機制和降解途徑進一步研究，并通過柑橘汁中的脫苦評價，以期提高該酶在實際生產(chǎn)上的適用性。