彭朝陽(yáng) 賈廷印 李好朝 喬澤強(qiáng)

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院普通外科,南陽(yáng)473058)

肝癌是全球第六大常見(jiàn)癌癥，占全球癌癥患者的5.6%，而且肝癌致死率高，肝癌致死人數(shù)占全球27種常見(jiàn)癌癥致死總數(shù)的9.1%，居第二位[1]。中國(guó)歷來(lái)就是肝癌高危地區(qū)，約一半的肝癌新增病例和死亡病例都發(fā)生在中國(guó)[2,3]。2015年中國(guó)新增肝癌病例46.6萬(wàn)，肝癌死亡病例42.2萬(wàn)[4]。肝癌給中國(guó)造成了嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。開(kāi)發(fā)有效的肝癌治療方法對(duì)中國(guó)衛(wèi)生醫(yī)療系統(tǒng)具有重要意義。大量研究表明在肝癌的治療中傳統(tǒng)中藥的輔助性治療有助于提高肝癌患者存活[5]。北五味子作為傳統(tǒng)中藥已具有幾千年的歷史，常被用于治療胃腸道疾病，呼吸衰竭，心血管疾病及過(guò)度出汗和失眠等。五味子乙素(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1 )是北五味子最主要的活性物質(zhì)，屬于聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，有利于膽囊癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等癌癥的治療[6,7]。但五味子乙素在肝癌中的研究還比較缺乏，有待進(jìn)一步研究。本研究主要目的是探索五味子乙素對(duì)高轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞HCCLM3存活和運(yùn)動(dòng)能力及血管新生因子的調(diào)節(jié)作用。

圖1 五味子乙素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1材料 高轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞系HCCLM3來(lái)源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。五味子乙素購(gòu)自Sigma公司。培養(yǎng)基 DMEM和胎牛血清購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。MTT購(gòu)自上海生工。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit和Transwell小室及人工基底膜購(gòu)自美國(guó)BD公司?？笲cl 2相關(guān)蛋白X(Bcl-2-associated X protein,Bax)抗體、抗B細(xì)胞淋巴瘤(B cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloprotein2,MMP-2)抗體、抗MMP-9抗體、抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)抗體、抗表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)抗體和抗成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 HCCLM3細(xì)胞于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到約80%時(shí)進(jìn)行傳代。不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、2、5、10、20、40、80、200、400 μmol/L) 五味子乙素處理HCCLM3后利用MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇5、10、20 μmol/L的五味子乙素進(jìn)行處理，對(duì)照組用DMSO代替五味子乙素。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞存活力 HCCLM3細(xì)胞制成1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)后棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、2、5、10、20、40、80、200、400 μmol/L)五味子乙素的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。向孔板中加入MTT溶液孵育4 h后棄上清，加入DMSO振蕩10 min，溶解結(jié)晶物后570 nm處檢測(cè)吸光值。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 五味子乙素處理48 h后，將各組待測(cè)細(xì)胞用1×的Binding buffer制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。接著用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色15 min，然后利用流式細(xì)胞儀對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4蛋白印跡 五味子乙素處理48 h后用PBS清洗待測(cè)細(xì)胞3次后，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min后等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%的BSA封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜孵育，第二天加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將各組細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。37℃培養(yǎng)24 h后，用0.5%的結(jié)晶紫對(duì)上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，用棉簽除去上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。顯微鏡下觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1五味子乙素對(duì)肝癌細(xì)胞HCCLM3存活力的影響 不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、2、5、10、20、40、80、200、400 μmol/L)五味子乙素處理HCCLM3后利用MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，分析五味子乙素對(duì)肝癌細(xì)胞存活力的影響。圖2 顯示，當(dāng)五味子乙素小于20 μmol/L時(shí)，HCCLM3細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著變化，維持在80%以上。當(dāng)五味子乙素大于20 μmol/L時(shí)HCCLM3細(xì)胞存活率急劇下降，降低到80%以下。上述結(jié)果表明，小于20 μmol/L的五味子乙素對(duì)HCCLM3細(xì)胞存活力無(wú)明顯影響，大于20 μmol/L的五味子乙素會(huì)降低HCCLM3細(xì)胞存活力。

2.2五味子乙素促進(jìn)HCCLM3細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)五味子乙素(5、10、20 μmol/L)處理后HCCLM3細(xì)胞凋亡率，分析五味子乙素對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。由圖3可知，5 μmol/L五味子乙素組細(xì)胞凋亡率與DMSO組無(wú)明顯變化，10和20 μmol/L五味子乙素組細(xì)胞凋亡率明顯高于DMSO組(P<0.05)。由此可見(jiàn)，五味子乙素具有誘導(dǎo)HCCLM3細(xì)胞凋亡的作用。

2.3五味子乙素對(duì)細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響 通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)五味子乙素對(duì)HCCLM3細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響。如圖4所示，5 μmol/L五味子乙素組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于DMSO組(P<0.05)。與DMSO組相比，10和20 μmol/L五味子乙素組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，五味子乙素會(huì)增強(qiáng)HCCLM3細(xì)胞Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)。

2.4五味子乙素降低HCCLM3細(xì)胞侵襲 利用Transwell檢測(cè)五味子乙素(5、10、20 μmol/L)處理后HCCLM3細(xì)胞侵襲，探究五味子乙素對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲的影響。由圖5可知，五味子乙素(5、10、20 μmol/L)組每個(gè)視野下侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯少于DMSO組(P<0.05)。上述結(jié)果表明，五味子乙素可減弱HCCLM3細(xì)胞侵襲。

圖2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.5五味子乙素抑制細(xì)胞侵襲標(biāo)記蛋白表達(dá) 蛋白印跡檢測(cè)HCCLM3細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)，分析五味子乙素對(duì)侵襲標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響。如圖6所示，五味子乙素(5、10、20 μmol/L)組MMP-2和MMP-9相對(duì)蛋白表達(dá)量明顯低于DMSO組(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，五味子乙素會(huì)降低HCCLM3細(xì)胞侵襲標(biāo)記蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)。

2.6五味子乙素減弱血管新生因子表達(dá) 為分析五味子乙素對(duì)HCCLM3細(xì)胞血管新生因子表達(dá)的影響，蛋白印跡檢測(cè)VEGF-A,EGF和bFGF表達(dá)。圖7顯示，5 μmol/L五味子乙素組EGF和bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于DMSO組(P<0.05)。與DMSO組相比，10和20 μmol/L五味子乙素組VEGF-A、EGF和bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。由此可見(jiàn)，五味子乙素可抑制HCCLM3細(xì)胞血管新生因子VEGF-A、EGF和bFGF表達(dá)。

圖4 蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)

圖5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲

圖6 蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞侵襲標(biāo)記蛋白表達(dá)

圖7 蛋白印跡檢測(cè)血管新生因子表達(dá)

3 討論

研究表明對(duì)不同階段的肝癌需選擇不同的治療方法，早期肝癌一般可以通過(guò)外科手術(shù)(部分肝切除或肝移植)進(jìn)行治療，但肝癌一旦轉(zhuǎn)移外科手術(shù)就不再適用，目前對(duì)中期和晚期的肝癌主要依靠化療、放療、靶向治療、免疫治療及溶瘤病毒治療等[8]。但這些方法存在著副作用大及效果不理想等缺點(diǎn)。越來(lái)越多的研究表明許多天然植物產(chǎn)物在癌癥治療方面發(fā)揮著積極作用[9,10]。

大量文獻(xiàn)報(bào)道多種植物提取物具有抑制癌細(xì)胞活力及促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的功效。有研究表明地耳草提取物可增強(qiáng)肝癌HepG2細(xì)胞Bax表達(dá)，減弱Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。Lin等[12]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于線(xiàn)狀花瞿麥的異紅草素可抑制肝癌HepG2細(xì)胞活力，提高Bax表達(dá)，降低Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有數(shù)據(jù)顯示來(lái)源于橘核的橘皮苷可增強(qiáng)肝癌HepG2細(xì)胞Bax表達(dá)，提高細(xì)胞凋亡[13]。據(jù)報(bào)道五味子乙素可減弱膽囊癌細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制Bcl-2表達(dá)，提高Bax表達(dá)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)在膽管細(xì)胞型肝癌中五味子乙素可降低細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減弱Bcl-2表達(dá)，增強(qiáng)Bax表達(dá)[14]。另外，五味子乙素還可減弱結(jié)腸直腸癌細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，小于20 μmol/L的五味子乙素對(duì)HCCLM3細(xì)胞存活力無(wú)明顯影響，大于20 μmol/L的五味子乙素會(huì)降低HCCLM3細(xì)胞存活力。五味子乙素(10、20 μmol/L)會(huì)增強(qiáng)Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

癌細(xì)胞侵襲能力在癌癥轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用。許多植物提取物可抑制癌細(xì)胞侵襲。有數(shù)據(jù)顯示雪蓮提取物和來(lái)源于菩提樹(shù)的三萜類(lèi)化合物都可以減弱肝癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)，降低胞侵襲能力[16,17]。另外，蟻巢木葉子提取物會(huì)降低肝癌SK-Hep1和 Huh7細(xì)胞MMP-2和MMP-9活性，減弱細(xì)胞侵襲能力[18]。有研究表明獼猴桃根提取物具有降低肝癌HepG2和MHCC97H細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)，抑制細(xì)胞侵襲的功效[19]。據(jù)報(bào)道在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，五味子乙素可降低MMP-9表達(dá)，抑制細(xì)胞侵襲[6]。有研究發(fā)現(xiàn)五味子乙素還可抑制肺腺癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)，減弱細(xì)胞侵襲能力[20]。本文結(jié)果表明，五味子乙素會(huì)降低HCCLM3細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)，減弱細(xì)胞侵襲能力。

越來(lái)越多的研究表明多種天然植物產(chǎn)物具有抑制血管新生的功能[21]。有數(shù)據(jù)顯示黃花敗醬提取物可降低結(jié)腸直腸癌細(xì)胞VEGF-A表達(dá)[22]。Atmaca等[23]發(fā)現(xiàn)三裂鼠尾草提取物可減弱前列腺癌細(xì)胞EGF和bFGF表達(dá)。有研究表明黃連提取物可抑制肝癌MHCC97L和HepG2細(xì)胞VEGF表達(dá)[24]。據(jù)報(bào)道苦味葉下珠及珍珠草提取物具有降低黑色素瘤細(xì)胞HIF-α和VEFG表達(dá)的功效[25]。本研究結(jié)果顯示，五味子乙素可抑制HCCLM3細(xì)胞血管新生因子VEGF-A、EGF和bFGF表達(dá)。

總體來(lái)說(shuō)，在高轉(zhuǎn)移能力的肝癌HCCLM3細(xì)胞中，五味子乙素可通過(guò)Bax/Bcl-2介導(dǎo)的信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；并通過(guò)降低MMP-2和MMP-9表達(dá)減弱細(xì)胞侵襲；同時(shí)還可抑制血管新生因子VEGF-A、EGF和bFGF表達(dá)。綜上訴述，五味子乙素可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HCCLM3凋亡，降低細(xì)胞侵襲能力及血管新生因子表達(dá)。后續(xù)將進(jìn)行體內(nèi)研究，分析五味子乙素對(duì)肝癌腫瘤進(jìn)程的影響，為挖掘新的肝癌治療方法提供理論依據(jù)。