張 震 張 毅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心，鄭州450052)

免疫治療已經(jīng)成為癌癥治療中最具有應(yīng)用前景的一種策略，并在臨床試驗中展現(xiàn)出了較好的療效。尤其是基因工程化T細胞能夠特異且有效殺傷腫瘤細胞，為實體瘤患者的治療帶來新的希望[1]。然而，無論是傳統(tǒng)的免疫細胞療法還是新型的嵌合抗原受體 T 細胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)及T細胞受體T細胞(T-cell receptor T cells,TCR-T)治療，均是基于終末分化效應(yīng)T細胞，使其難以在體內(nèi)發(fā)揮持久的抗腫瘤效應(yīng)[2]。已有研究表明，過繼輸注的年輕化T細胞能夠在小鼠體內(nèi)自我更新及分化,具有長期存活的能力，并展示出顯著優(yōu)于終末分化的效應(yīng)T細胞的抗腫瘤能力[3-5]。這些研究提示，低分化狀態(tài)的免疫細胞在臨床治療中可能更具有應(yīng)用潛力。

記憶性T細胞是一群異質(zhì)性的細胞亞群，在腫瘤免疫應(yīng)答和免疫記憶維持中發(fā)揮重要作用[6]。由于分化程度的不同使T細胞亞群在生物學(xué)特征和抗腫瘤效應(yīng)等方面存在顯著差異。記憶性T細胞的分化受到多種因素如轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子、代謝檢查點及microRNA(miRNA)等的調(diào)控[7,8]。因此，探究T細胞分化過程及如何在體外擴增出更多年輕化、抗腫瘤能力強的免疫細胞使腫瘤患者受益是目前國內(nèi)外研究的熱點。本文將從記憶性T細胞的表型、功能、分化機制及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用等方面進行深入探討，以期為免疫治療提供新的思路。

1 記憶性T細胞的表型與特征

記憶性T細胞起源的研究基于Youngblood等[9]研究團隊的成果， 他們利用小鼠感染模型證實了初始T細胞(na?ve T cell,Tn)在受到病原體感染時迅速獲得效應(yīng)功能分化為效應(yīng)T細胞(effector T cell,Teff)。大部分Teff細胞在清除病原體后凋亡，但仍存在一小部分長壽命的記憶性T細胞亞群，再次發(fā)生感染時，這群細胞能夠快速增殖分化。隨著記憶性T細胞分化程度的增加，其自我更新和存活能力逐漸下降[10]。根據(jù)細胞表面趨化因子受體(CCR7)和淋巴結(jié)歸巢分子(CD62L)將記憶性T細胞分為中心記憶性T細胞(central memory T cell,Tcm)和效應(yīng)記憶性T細胞(effector memory T cell,Tem)[11]。Tcm細胞表型為CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-，由于其高表達CCR7和CD62L分子而具有快速增殖和分化的特征，能夠歸巢至次級淋巴器官。Tem細胞表型為CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-，具有較強的溶細胞功能，可遷移至炎癥組織中迅速發(fā)揮效應(yīng)功能。Villani等[12]通過基因表達譜發(fā)現(xiàn)Tcm細胞高表達Eomes、TCF-1、FOXP1等早期分化相關(guān)基因，而Tem細胞高表達Tbx21、PRDM1、Granzyme等效應(yīng)相關(guān)基因，提示不同記憶亞群T細胞其表型和基因表達譜具有差異性。

最近研究發(fā)現(xiàn)在靈長類及人類的外周血中存在一群比例較低的干細胞樣T細胞(stem memory T cell,Tscm)[13]。隨著Tscm細胞的發(fā)現(xiàn)，研究者對T細胞線性分化模式進行了深入研究：Tn-Teff-Tscm-Tcm-Tem-Teff[14]。Gattinoni等[15]采用流式細胞術(shù)對人外周血中Tscm表型進行鑒定，發(fā)現(xiàn)這群細胞同時具有Tn和Tcm細胞的一些共有表型，即表達CD45RO-CD45RA+CCR7+CD62L+CD95+，歸巢于淋巴結(jié)。同時，Tscm細胞高表達IL-2Rβ(CD122)、IL-7Rα(CD127)、CD28和CD27等與T細胞早期分化相關(guān)的分子，低表達CD57和KLRG-1等與T細胞衰老相關(guān)的標(biāo)志物[15]。Tscm細胞具有較強的自我更新能力，能夠在體內(nèi)發(fā)揮長期抗腫瘤效應(yīng)，是免疫細胞治療中最具有應(yīng)用前景的細胞亞群。

2 記憶性T細胞的臨床意義和功能

記憶性T細胞在患者外周血及腫瘤微環(huán)境中的比例與預(yù)后密切相關(guān)，能夠作為提示單抗治療及化療等的療效指標(biāo)。在57%惡性黑色素瘤患者中發(fā)現(xiàn)外周血CD45RO+CD8+T細胞的比例顯著低于正常水平，這群患者對PD-1單抗治療無效，而外周血中含有較高水平記憶性T細胞的患者能夠?qū)慰怪委熡行?，提高其生存期[16]。在非小細胞肺癌患者中，腫瘤組織浸潤的CD45RO+CD8+T細胞比例與患者預(yù)后呈正相關(guān)[17]。Lieben等[18]報道了在惡性卵巢癌患者腹水中的巨噬細胞大量產(chǎn)生CXCL9，通過與其受體CXCR3結(jié)合招募Tem細胞，進一步檢測外周血與腹水中Tn、Tcm、Tem和Teff細胞亞群，發(fā)現(xiàn)Tem細胞比例顯著增加且提示患者具有較好的預(yù)后。因此，記憶性T細胞在患者腫瘤微環(huán)境中的浸潤是評估其預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

不同亞群T細胞在分泌細胞因子及抗腫瘤免疫中發(fā)揮不同的作用。傳統(tǒng)選擇過繼性輸注的T細胞是根據(jù)其能否產(chǎn)生大量IFN-γ和特異性殺傷靶細胞。在體外試驗中發(fā)現(xiàn)Tem細胞分泌IFN-γ的水平較高，其清除抗原能力強，可以作為免疫細胞治療的亞群。但是將Tscm、Tcm和Tem細胞分別過繼輸注至小鼠體內(nèi)后，約60%的Tscm細胞能夠維持其表型，僅有30%的Tcm細胞維持其細胞表型，而Tem細胞快速進入終末分化階段[15]。因此，Tem細胞在體內(nèi)的存活能力及殺傷效果較差。Tcm細胞能夠引起腫瘤的消退，其體內(nèi)殺傷功能顯著優(yōu)于Tem細胞。Tscm細胞分泌IL-2的水平較高、具有干性和分化為其他記憶亞群的特性，使其在淋巴結(jié)和非淋巴組織中均具有較強的增殖能力，并在小鼠體內(nèi)長期存活。Nicoletta等[19]報道了通過體外分選健康供者Tn 細胞，采用 CD3/CD28 beads 活化后加入 IL-7 和 IL-15 等細胞因子進行培養(yǎng)，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生大量表達 CD45RA、CD95、CCR7和CD62L 的Tscm細胞。同時將體外誘導(dǎo)的各亞群T細胞輸注至免疫缺陷小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Tscm細胞能夠顯著延長小鼠生存期。這些結(jié)果說明Tscm細胞抗腫瘤活性及體內(nèi)生存能力均優(yōu)于其他亞群。

3 調(diào)控記憶性T細胞分化的機制

免疫治療成功的一個關(guān)鍵因素是獲得免疫記憶性，即輸注的T細胞亞群能夠在體內(nèi)維持自我更新和分化，從而有效殺傷腫瘤細胞。已有文獻報道在Tn細胞分化為記憶性T細胞的過程中具有可塑性并受到多種因素的調(diào)控。因此，明確影響T細胞分化的機制，對體外獲得更多年輕狀態(tài)T細胞并用于免疫細胞治療非常重要。以下，我們將重點逐一分析轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子、代謝檢查點和miRNA等在調(diào)控記憶性T細胞分化中的作用。

3.1轉(zhuǎn)錄因子 隨著二代測序技術(shù)的普及，T細胞分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子逐漸被發(fā)現(xiàn)，它們在調(diào)控記憶性或效應(yīng)性T細胞相關(guān)基因表達中發(fā)揮重要作用。在記憶性T細胞分化為Teff的過程中，多種轉(zhuǎn)錄因子如脫中胚蛋白(Eomesodermin,Eomes)、T細胞轉(zhuǎn)錄因子(T cell factor-1,TCF-1)、淋巴增強轉(zhuǎn)錄因子(Lymphoid enhancer-binding factor-1,LEF-1)及人runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(human runt-related transcription factor 3,Runx3)的表達逐漸下降，而T-bet及B 淋巴細胞誘導(dǎo)成熟蛋白-1(B lymphocyte-induced maturation protein 1,Blimp-1)的表達水平增加[20,21]。其中Eomes和T-bet能夠調(diào)節(jié)T細胞發(fā)育和自穩(wěn)態(tài)平衡[22]。T-bet屬于T-box家族成員，主要功能是通過上調(diào)KLRG-1的表達促進T細胞向終末狀態(tài)分化。小鼠實驗發(fā)現(xiàn)IL-12能夠誘導(dǎo)T-bet的表達，產(chǎn)生一群表型為IL-7RloKLRG-1hi的終末分化前體細胞。敲除小鼠T-bet基因后，可誘導(dǎo)T細胞高表達IL-7R并向記憶前體細胞分化[23]。Knudson等[24]報道了Eomes 在記憶性T細胞上高表達且是Tcm細胞表型維持的關(guān)鍵因子。進一步研究發(fā)現(xiàn)，采用NF-κB抑制劑處理T細胞后降低了Eomes的表達水平，說明NF-κB通路活性能夠維持記憶性T細胞Eomes的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，TCF-1和LEF-1在記憶性T細胞高表達，能夠維持其自我更新能力，且淋巴結(jié)中TCF-1表達水平顯著高于其他組織，表明TCF-1是記憶性T細胞的特征性標(biāo)志物[25]。Runx家族的3個成員Runx1、Runx2和Runx3是調(diào)控T細胞發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子[26]。其中，在Runx3敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)外周CD8+T細胞比例顯著下降，其增殖能力也降低。此外，Runx3能夠調(diào)控組織記憶性CD8+T細胞的分化與自穩(wěn)態(tài)[27]。在惡性黑色瘤小鼠模型中輸注高表達Runx3的T細胞能夠減緩腫瘤生長，延長小鼠生存期。因此，記憶性T細胞的分化受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，然而不同轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用有待進一步研究。

3.2細胞因子 大量文獻表明，在免疫細胞培養(yǎng)體系中添加不同細胞因子可使其向記憶性或效應(yīng)性T細胞分化。已有研究證實IL-2誘導(dǎo)T細胞向Teff分化，而IL-7、IL-15及IL-21等能夠誘導(dǎo)記憶性T細胞分化[28]。IL-7屬于促紅細胞生成素家族Ⅰ型短鏈細胞因子，主要在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮作用。IL-7與其受體 IL-7R 結(jié)合后對T細胞的穩(wěn)態(tài)及記憶性維持方面的功能已經(jīng)較明確，但相關(guān)機制仍需進一步探究[29]。IL-15 能夠誘導(dǎo) T 細胞的活化、延長其生存時間。同時，IL-15誘導(dǎo)產(chǎn)生具有高親和性的抗原特異性T細胞并維持其記憶性。IL-15與其受體 IL-15R 結(jié)合后激活免疫細胞 STAT3 和 STAT5 通路,并招募下游 PI3K 或 AKT 的活化，從而促進T細胞的增殖[30]。在體外，IL-7和IL-15聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生Tscm細胞，為過繼細胞免疫治療提供具有較強抗腫瘤活性的細胞亞群。IL-21與IL-15結(jié)構(gòu)相似，通過誘導(dǎo)早期分化的表型對 Tcm 細胞的維持和發(fā)育起到重要作用。同時，IL-21誘導(dǎo)的記憶性細胞與CTLA-4單抗聯(lián)合后可以應(yīng)用于臨床患者的治療[31]。目前，采用小分子化合物如TWS119及雷帕霉素等能夠在體外誘導(dǎo)記憶性T細胞。在我們的研究中，使用了IL-7、IL-15或IL-21與TWS119聯(lián)合培養(yǎng)免疫細胞，采用流式細胞術(shù)檢測細胞記憶表型發(fā)現(xiàn)IL-7+IL-21+TWS119組合顯著促進Tscm和Tcm細胞形成，并降低PD-1和Tim-3的表達水平。與單獨TWS119或聯(lián)合其他細胞因子組相比較，IL-7和IL-21增強了CD8+T細胞分泌促炎性細胞因子的能力并抑制了T細胞的凋亡。然而，采用細胞因子與藥物聯(lián)合促進記憶性T細胞分化的機制仍有待研究。

3.3代謝檢查點 T細胞在分化過程中發(fā)生了代謝重編程，即Tn細胞由于能量需求低主要通過氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)獲得ATP。Teff細胞處于活化狀態(tài)主要通過糖酵解(Glycolysis)方式獲得營養(yǎng)物質(zhì)使T細胞快速增殖、清除腫瘤細胞。Teff細胞分化為記憶性T細胞后其線粒體呼吸增加，轉(zhuǎn)化為脂肪酸氧化(Fatty acid oxidation,FAO)和氧化磷酸化[32]。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞通過競爭性利用糖酵解抑制T細胞的代謝重編程，使記憶性T細胞形成受到抑制。越來越多的證據(jù)表明了代謝對T細胞分化影響的重要性，發(fā)現(xiàn)T細胞代謝受到檢查點AMPK、mTOR、Myc 和 HIF-1α的調(diào)控[8,33-35]。AMPK是結(jié)構(gòu)上高度保守的蘇氨酸/絲氨酸激酶的異源三聚體復(fù)合物，影響胞內(nèi)AMP 和ATP 的水平。當(dāng)AMP/ATP升高時，激活A(yù)MPK從而降低T細胞糖酵解水平、增加其氧化磷酸化水平[36]。二甲雙胍作為AMPK的激活劑能夠顯著抑制腫瘤細胞生長、提高患者的生存期[37]。Eikawa等[38]報道了服用二甲雙胍的小鼠移植瘤模型中腫瘤生長受到抑制，同時發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤性T細胞(Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)數(shù)目增加、耗竭性表面標(biāo)志物表達水平下調(diào)，從而促進記憶性T細胞產(chǎn)生并增強其殺傷腫瘤的能力。因而，二甲雙胍能夠影響體內(nèi)記憶性T細胞分化，為優(yōu)化培養(yǎng)體系提供較好的策略。mTOR、Myc和HIF-1α主要調(diào)控T細胞的糖酵解，促進Teff分化。已有文獻報道采用mTOR抑制劑雷帕霉素處理T細胞后促進Tscm的產(chǎn)生，降低2-NBDG的表達水平，使T細胞糖酵解受到抑制。相反的，mTOR的活化能夠促進myc和HIF-1α的表達，進一步上調(diào)糖酵解相關(guān)基因Glut-1和限速酶HK2的表達，從而使T細胞糖酵解水平增加，影響記憶性T細胞的分化[39]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，抑制Glut-1的表達可增加T細胞的氧化磷酸化水平，同時促進Tcm細胞形成[40]。因此，靶向代謝檢查點可以使T細胞向記憶性分化，為免疫治療提供更多年輕狀態(tài)的T細胞。

3.4miRNA miRNA 是一類內(nèi)源性平均長度約為18～24個核苷酸的非編碼小分子 RNA，在基因翻譯后修飾調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究表明在 T 細胞中敲低miRNA成熟密切相關(guān)的 Dicer 酶的表達能夠影響 T 細胞活化與增殖，提示 miRNA 對 T 細胞分化至關(guān)重要[41-43]。miRNA的表達譜隨著記憶性 T 細胞形成發(fā)生了顯著變化。在我們的報道中，采用熒光定量PCR檢測了Tn、Teff和記憶性T細胞(Tm)上34種miRNA的表達，通過篩選發(fā)現(xiàn)miR-143在Tn和Tcm細胞中高表達，而在Teff細胞中低表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-143通過靶向Glut-1抑制其表達，從而降低T細胞糖酵解水平，促進Tcm的形成。同時，我們檢測發(fā)現(xiàn)miR-143在食管癌患者腫瘤組織中表達水平顯著低于癌旁組織，而Glut-1在癌組織中顯著高表達。通過分析腫瘤微環(huán)境中免疫抑制因素，我們發(fā)現(xiàn)IDO能夠抑制miR-143的表達，使腫瘤組織中浸潤的記憶性T細胞比例減少。然而，IDO如何通過調(diào)控miR-143表達進而影響患者體內(nèi)記憶性T細胞形成還有待進一步研究[40]。此外，有文獻報道m(xù)iR-28能夠降低腫瘤微環(huán)境中耗竭性標(biāo)志物PD-1的表達并改善T細胞功能，提示miR-28在逆轉(zhuǎn)耗竭性T細胞分化為記憶性T細胞方面具有重要作用，但其具體機制尚不清楚[44]。同時，有研究表明miR-17-92家族成員通過調(diào)控PI3K-AKT-mTOR信號通路促進效應(yīng)T細胞分化。在小鼠模型中通過敲除miR-17-92家族能夠促進記憶性T細胞的分化[45,46]。此外，多種miRNA如miR-21、miR-23 及miR-155等參與調(diào)控T細胞的功能獲得與分化[43]。因此，miRNA能夠通過調(diào)控基因表達及信號通路活性影響T細胞分化，為免疫治療提供新的靶點。

4 記憶性T細胞與免疫治療的關(guān)系

以靶向 CD19 為代表性的 CAR-T 細胞治療兒童及成人復(fù)發(fā)難治性急性淋巴細胞白血病的完全緩解率(Complete remission,CR)可達 90%以上[47,48]?；贑AR-T細胞在血液系統(tǒng)腫瘤治療中取得的良好療效及大量臨床試驗的安全評估，美國 FDA 已于 2017 年批準(zhǔn) Kymriah 和 Yescarta 兩種類型的 CAR-T 細胞作為藥物上市。CAR-T細胞在血液系統(tǒng)腫瘤治療中獲得成功的關(guān)鍵因素之一是患者體內(nèi)能夠形成記憶性T細胞。Sabatino等[49]的研究團隊在體外培養(yǎng)過程中獲得了大量臨床級別的干細胞樣CAR-T細胞，主要是采用TWS119聯(lián)合IL-7和IL-21等細胞因子的培養(yǎng)體系擴增出表型為CD8+CD45RO-CCR7+CD45RA+CD62L+CD27+CD95+的CAR-T細胞。在小鼠白血病移植瘤模型中，輸注干細胞樣CAR-T細胞能夠發(fā)揮持久的抗腫瘤效應(yīng)。Ghassemi等[50]通過收集第3天～第5天和第9天的CAR-T細胞，比較其分化狀態(tài)及抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)縮短CAR-T細胞培養(yǎng)時間可以獲得較多低分化狀態(tài)的細胞亞群，在體內(nèi)具有較強的抗腫瘤活性。然而，CAR-T細胞在治療實體瘤方面進展緩慢，接受靶向表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的 CAR-T 細胞治療后，僅 18.18% 的晚期肺癌患者出現(xiàn)部分緩解，其余患者均無反應(yīng)[51]。TCR-T細胞在實體瘤治療中具有較好的臨床應(yīng)用前景，但是由于腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用及體外經(jīng)TCR基因轉(zhuǎn)染的T細胞處于終末分化狀態(tài)等使很多患者無法受益[52]。因此，體外通過采用細胞因子及小分子化合物TWS119等方案誘導(dǎo)Tscm亞群或通過靶向代謝檢查點獲得大量Tcm細胞亞群是目前提高免疫治療療效的有效手段。同時，將抗原特異性TCR基因或者CAR載體轉(zhuǎn)染至Tscm或Tcm亞群，獲得能夠在體內(nèi)發(fā)揮持久抗腫瘤效應(yīng)的基因工程化T細胞并輸注給患者也會為細胞免疫治療帶來更好的效果(圖1)。一項臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)，基因改造后的Tscm在體內(nèi)存活長達12年，并具有良好的安全性和功能[53]。綜上所述，Tscm和Tcm細胞亞群在臨床抗腫瘤免疫治療中具有較好的臨床應(yīng)用前景，可以為改善患者預(yù)后提供個性化的治療方案。

圖1 記憶性T細胞亞群在腫瘤免疫治療中的作用

5 總結(jié)與展望

免疫治療已經(jīng)成為腫瘤治療的重要手段，而獲得具有免疫記憶性的T細胞能夠增強治療的持久性和有效性。不同亞群記憶性T細胞可根據(jù)其表面標(biāo)志物、基因表達譜及代謝方式等進行鑒定。在臨床前試驗中已經(jīng)證實體內(nèi)記憶性T細胞的形成可以顯著抑制小鼠腫瘤生長，延長其生存期。同時，通過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)可獲得臨床級別的記憶性T細胞。但仍存在許多問題需要解決：(1)闡明維持記憶性T細胞表型的相關(guān)分子機制及表觀遺傳修飾的影響；(2)部分患者由于免疫狀態(tài)低下難以獲得足夠數(shù)量的免疫細胞進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；(3)輸注的免疫細胞易受到微環(huán)境的抑制難以發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。如何清除腫瘤微環(huán)境中的抑制因素如髓源性抑制細胞(MDSC)、巨噬細胞(Macrophage)及調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)等，使記憶性T細胞能夠達到腫瘤部位并殺傷腫瘤細胞是目前值得關(guān)注的重要科學(xué)問題。同時，值得注意的是單一的治療方式并不能有效清除腫瘤細胞，應(yīng)將免疫細胞治療與PD-1單抗、CTLA-4單抗或放、化療等治療方式相結(jié)合，從而使患者獲得更好的療效。綜上所述，記憶性T細胞顯示了優(yōu)越的臨床應(yīng)用潛能，我們堅信其會在未來的免疫治療中發(fā)揮重要作用。