張 行 田曉曉 董文芳 王茹夢 潘紅春

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點實驗室,生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點實驗室, 蕪湖 241000)

即使在最適條件下, 植物的葉綠體、線粒體以及與生物膜偶聯(lián)的電子傳輸系統(tǒng)都能產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species, ROS)[1—3], 根據(jù)是否含有靜電荷可分為自由基ROS (含靜電荷)和非自由基ROS(不含靜電荷), 其中H2O2是相對穩(wěn)定的非自由基ROS。在正常生理狀態(tài), 包括H2O2在內(nèi)的ROS作為光合氧化碳循環(huán)及光呼吸作用等代謝途徑副產(chǎn)物在植物細(xì)胞中不斷合成[4, 5]; 而在病原體感染、植株被外力傷害、紫外線輻射、強(qiáng)光輻射、干旱、鹽堿腐蝕及溫度劇烈變化等生物或非生物壓力脅迫時, 植物細(xì)胞內(nèi)ROS含量會明顯增加即所謂的氧化迸發(fā)[6]。ROS在細(xì)胞內(nèi)的累積會引起氧化壓力, 從而對蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生氧化性損傷, 因此ROS的產(chǎn)生和清除之間的平衡對于保持植物細(xì)胞正常生理功能非常關(guān)鍵[7, 8]。植物細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)是抵抗ROS的主要因子, 其中APX是植物細(xì)胞清除H2O2代表性的抗氧化酶[9]。APX利用抗壞血酸(Ascorbate, AsA)作為特殊電子供體將H2O2還原為H2O, 同時伴隨著單脫氫抗壞血酸(Monodehydroascorbate, MDAsA)的產(chǎn)生。植物細(xì)胞有2種途徑可以把MDAsA還原成AsA。第一種途徑是通過NAD (P)H依賴的單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAsA reductase)的作用直接把MDAsA還原成AsA; 第二種途徑是MDAsA可以自發(fā)地轉(zhuǎn)變成AsA和脫氫抗壞血酸(Dehydroascorbate, DAsA), 接著脫氫抗壞血酸還原酶(DAsA reductase)利用谷胱甘肽(Glutathione, GSH)把DAsA還原成AsA, 而被氧化的GSH再通過GSH還原酶的作用被還原成GSH[10]。因此, 植物細(xì)胞清除H2O2主要賴以APX與AsA-GSH循環(huán)的協(xié)同作用。

綜上所述, APX是植物細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶,還由于目前已鑒定的APX酶蛋白或克隆到的APX基因絕大部分來自植物界物種[11], 所以一般認(rèn)為APX是植物界特有的蛋白。盡管如此, 在非植物界的少量物種中也發(fā)現(xiàn)了APX蛋白或APX基因[12, 13],Mathews等[12]通過生物化學(xué)方法測定到了棉鈴蟲(Helicoverpa zea)整體勻漿液具有APX活性, 這是在動物體中首次發(fā)現(xiàn)APX, 但未見后續(xù)關(guān)于棉鈴蟲APX基因克隆的相關(guān)研究; 隨著核酸測序技術(shù)特別是高通量測序技術(shù)的發(fā)展, 獲得的各類動物表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence tags, ESTs)及基因組數(shù)據(jù)呈現(xiàn)爆發(fā)式增長, 通過生物信息學(xué)分析陸續(xù)在鞭毛蟲(Thecamonas trahens)、堡礁海綿(Amphimedon queenslandica)、2種水螅(H. vulgaris及H. viridissima)[14, 15]、3種寄生于鮭魚體內(nèi)的甲殼綱動物(Caligus clemensi,C.rogercresseyi和Lepeophtheirus salmonis)及腕足動物海豆芽(Lingula anatina)中發(fā)現(xiàn)了APX基因序列, 但目前對非植物界物種的APX基因的來源及其編碼蛋白的生理功能知之甚少?；诖? 本研究基于刺胞動物門兩種水螅(H.vulgaris及H. viridissima)APX基因比對后保守區(qū)序列數(shù)據(jù)設(shè)計引物[14, 15], 運用RACE技術(shù)克隆了中國綠水螅(H. sinensis)APX基因全長cDNA序列, 并進(jìn)一步利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組APX蛋白, 再把該重組蛋白作為抗原免疫新西蘭兔制備APX多克隆抗體。在此基礎(chǔ)上, 采用實時定量PCR及免疫印跡方法對中國綠水螅APX表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析。因此, 本研究為探討水螅APX基因的來源和進(jìn)化、以及進(jìn)一步了解APX在水螅生理活動過程中的作用等方面提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中國綠水螅(H. sinensis)原種采集于廣東省惠州市東江流域, 從野外采集的水螅活體標(biāo)本中選取1只個體單獨培養(yǎng), 據(jù)此建立中國綠水螅單克隆無性繁殖系。每天用豐年蟲(Artemiasp.)幼蟲喂食水螅1次, 喂食后及時更換培養(yǎng)液。水螅培養(yǎng)液由冷卻后充氧的單蒸水配制(配方為: 1 mmol/L NaCl,1 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L KCl, 0.1 mmol/L MgSO4,1 mmol/L Tris, pH 7.4)。中國綠水螅單克隆無性繁殖系長期保持在培養(yǎng)條件穩(wěn)定的光照培養(yǎng)箱內(nèi)[溫度(25±0.5)℃, 光照度2000 lx, 每天光照12h]。

1.2 中國綠水螅SMART RACE cDNA文庫的制備

挑取50只中國綠水螅, 饑餓2d后采用RNA抽提試劑盒(Sangon, 中國)提取總RNA, 再使用mRNA分離提純試劑盒(Sangon, 中國)從總RNA中純化mRNA。以mRNA為模板, 采用SMART RACE cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Clontech, 美國)制備RACE cDNA文庫[16],cDNA文庫凍存于-80℃低溫冰箱備用。所有實驗操作參照試劑盒說明書。

1.3 5′RACE及3′RACE

根據(jù)GenBank中2種水螅(H. vulgaris, XM_002158468;H. viridissima, AY608909)APX基因cDNA序列, 運用Clustal 2.0軟件[17]比對二者序列數(shù)據(jù)以分析保守序列, 再采用Oligo 7.0軟件設(shè)計兩條引物5′APX及3′APX(表 1)。其中引物5′APX與試劑盒接頭引物5′adapter primer(表 1)配對進(jìn)行5′ RACE;引物3′APX與試劑盒接頭引物3′ adapter primer(表1)配對進(jìn)行3′ RACE。RACE PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照SMART RACE cDNA文庫構(gòu)建試劑盒說明書。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳, 然后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后與pMD 18-T克隆載體連接, 連接液轉(zhuǎn)化E. coliJM109菌株。菌落PCR方法篩選陽性克隆, 陽性克隆送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 APX基因全長cDNA序列的克隆

根據(jù)5′RACE和3′RACE PCR產(chǎn)物測序結(jié)果設(shè)計用于擴(kuò)增中國綠水螅APX基因全長cDNA序列的特異性引物APX-F及APX-R(表 1), PCR反應(yīng)體系含10×buffer 5.0 μL, 25 mmol/L MgCl26.0 μL, 2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL, 上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,TaqDNA聚合酶1.2 μL(5 U/μL), 模板(中國綠水螅SMART RACE cDNA文庫)3 μL, 使用滅菌去離子水將反應(yīng)總體積補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)體系在94℃預(yù)變性5min, 然后進(jìn)入如下循環(huán): 94℃變性30s, 48℃退火30s, 72℃延伸60s, 循環(huán)次數(shù)為35, 循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,然后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后與pMD18-T克隆載體連接, 連接液轉(zhuǎn)化E. coliJM109菌株。菌落PCR方法篩選陽性克隆, 陽性克隆送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。再采用質(zhì)粒抽提試劑盒(Sangon, 中國)提取重組質(zhì)粒pMD18-T-APX。

1.5 APX基因編碼區(qū)全長DNA序列的克隆

挑取50只中國綠水螅, 饑餓2d后采用動物細(xì)胞總DNA抽提試劑盒(Sangon, 中國)提取總DNA, 再使用DNA純化試劑盒(Sangon, 中國)純化總DNA。以總DNA為模板, 使用Long PCR試劑盒(Sangon, 中國)擴(kuò)增APX基因編碼區(qū)全長DNA。Long PCR實驗操作參照試劑盒說明書。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

表 1 本文所用引物序列Tab. 1 PCR primers used in the study

1.6 生物信息學(xué)分析

將測得的中國綠水螅APX基因全長cDNA序列通過DNAClub軟件進(jìn)行編碼蛋白的氨基酸序列的預(yù)測, 在SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/secpred_sopma.pl)網(wǎng)站在線分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu), 在SWISS-MODEL網(wǎng)站(http://swissmodel.expasy.org/interactive)通過同源建模方法預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)3-D圖像文件通過生物圖像分析軟件AntheProt_3D進(jìn)行解析。

將預(yù)測的中國綠水螅APX氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)BLAST在線分析, 獲得相應(yīng)的同源序列; 再將中國綠水螅APX氨基酸序列與其同源蛋白質(zhì)氨基酸序列數(shù)據(jù)通過Clustal 2.0軟件[17]進(jìn)行比對?；贏PX氨基酸序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)生分析時, 內(nèi)群包括不同來源的44個同源序列, 外群為來自于真菌界的3個同源序列。使用Modeltest 3.7檢驗序列數(shù)據(jù)并選擇合適的建樹參數(shù)模型[18]。通過PAUP 4.0b10軟件[19], 基于Jones-Taylor-Thornton模型用最大似然法(Maximum-likelihood, ML)重建分子系統(tǒng)發(fā)生樹。ML系統(tǒng)發(fā)生樹中各節(jié)點的置信度由全部運算1000次自引導(dǎo)法重復(fù)檢驗。另外, 使用MrBayes 3.2.3軟件[20], 基于Jones-Taylor-Thornton模型并同時啟動4條馬爾可夫鏈(包括冷鏈1條, 熱鏈3條)。以隨機(jī)樹為起始樹, 運行3×106代, 每100代對系統(tǒng)樹進(jìn)行重新取樣構(gòu)建貝葉斯樹(Bayesian inference tree, BI), 系統(tǒng)發(fā)生樹各節(jié)點的置信度通過后驗概率(Posterior probability, PP)檢測。

1.7 APX基因的原核表達(dá)及重組蛋白的純化、濃縮與鑒定

為制備中國綠水螅APX重組蛋白, 根據(jù)原核表達(dá)質(zhì)粒pET-GST的多酶切位點種類及目的基因核苷酸序列特征設(shè)計及合成引物PE-APS-F(含BamHⅠ酶切位點)及PE-APS-R(含EcoR Ⅰ酶切位點)(表 1)。但中國綠水螅APX基因編碼區(qū)的586—591位點有一個BamH Ⅰ酶切位點, 1044—1049位點有一個EcoR Ⅰ酶切位點。為人工突變(核苷酸位點突變但對應(yīng)的氨基酸位點不變化)這2個酶切位點, 我們設(shè)計了APS-OEP-1, APS-OEP-2及APSOEP-3等3條引物用于重疊延伸PCR(表 1)。引物PE-APS-F和引物APS-OEP-2配對、以本研究制備的重組質(zhì)粒pMD18-T-APX為模板擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Ⅰ;引物APS-OEP-1和引物APS-OEP-3配對、以質(zhì)粒pMD18-T-APX為模板擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Ⅱ; 再以上述的PCR產(chǎn)物I和PCR產(chǎn)物Ⅱ為引物(50 μL PCR反應(yīng)體系中各加1 μL)、無需添加模板進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Ⅲ; 最后引物PE-APS-F和引物PE-APS-R配對、以PCR產(chǎn)物Ⅲ為模板擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Ⅳ。

采用高保真PCR試劑盒(TaKaRa, 日本)進(jìn)行上述的系列PCR反應(yīng), PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照試劑盒說明書。PCR產(chǎn)物Ⅳ及原核表達(dá)質(zhì)粒pETGST[21]分別用BamH Ⅰ及EcoR Ⅰ雙酶切, 酶切產(chǎn)物各自經(jīng)切膠純化后連接, 再通過分子克隆方法制備重組質(zhì)粒pET-GST-APS。重組質(zhì)粒pET-GSTAPS轉(zhuǎn)化E. coliBL21 (DE3)菌株, IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)后的E. coliBL21 (DE3)菌體經(jīng)超聲破碎后采用Ni-NTA His-Band樹脂親和層析柱試劑盒(Qiagen, 德國)純化重組蛋白, 再使用蛋白質(zhì)濃縮管通過離心方法濃縮重組蛋白。濃縮后的重組蛋白先進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 然后再電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 再按照潘紅春等[22]的方法測定重組蛋白N末端10個氨基酸殘基的序列以鑒定重組蛋白。

1.8 多克隆抗體制備

用于免疫的新西蘭兔分為免疫組(1只)與對照組(3只), 免疫組被注射弗氏佐劑與重組APX蛋白的乳化劑, 對照組被注射弗氏佐劑和PBS的乳化劑。每組動物在第0、第2、第4及第6周各免疫1次, 共4次。第1次基礎(chǔ)免疫使用弗氏完全佐劑, 后3次加強(qiáng)免疫均使用弗氏不完全佐劑, 采用背部皮下多點注射免疫方法。分別于第0、第2、第4、第6及第8周靜脈采血, 共5次。通過ELISA方法確定抗血清針對抗原蛋白的效價, 采用Protein A sepharose CL-4B親和層析試劑盒(PrimeGene, 中國)從抗血清中分離純化APX多克隆抗體[23]。

1.9 APX基因表達(dá)分析

在不同光照時長條件下培養(yǎng)中國綠水螅 準(zhǔn)備7臺光照培養(yǎng)箱[溫度(25±0.5)℃, 光照度2000 lx],光周期分別設(shè)置為0 L∶24D(在1個24h周期內(nèi)光暴露0h、黑暗24h)、4 L∶20D、8 L∶16D、12 L∶12D、16 L∶8D、20 L∶4D及24 L∶0D。每個培養(yǎng)箱放3個培養(yǎng)盒, 每盒放中國綠水螅200只。每天喂食1次,喂食后30min時換培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)水螅30d。

qPCR分析 在不同光照時長條件下培養(yǎng)中國綠水螅的實驗結(jié)束后, 從每個培養(yǎng)盒中挑取50只中國綠水螅, 饑餓2d后采用RNA抽提試劑盒(Sangon, 中國)提取總RNA。以總RNA為模板, 采用Prime Script? 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, 日本)試劑盒合成第一鏈cDNA。具體實驗操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

根據(jù)本研究得到的中國綠水螅APX基因編碼區(qū)序列設(shè)計用于qPCR的引物Q-APX-F及Q-APXR(表 1), 再根據(jù)3種刺胞動物Actin基因cDNA序列(AY423388, XM_002154426及M32364)比對后結(jié)果選取其中完全保守區(qū)序列設(shè)計引物Q-Actin-F及QActin-R(表 1)。采用SYBR?Premix ExTaq?(TliRNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa, 日本)和CFX96實時定量PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad, 美國)進(jìn)行qPCR反應(yīng)。具體qPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照試劑盒說明書。同一樣品重復(fù)3個反應(yīng), 以actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后導(dǎo)出各樣本的Ct (threshold cycle)值, 隨后采用2-ΔΔCt法[24]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和表達(dá)差異分析。采用SSPS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析, 使用Duncan’s multiple-range test進(jìn)行相對表達(dá)分析,P＜0.05表示存在顯著性差異。

Western blotting分析 采用Western Blotting檢測試劑盒(Baiaolaibo, 中國)進(jìn)行Western Blotting分析[25], 實驗操作參照試劑盒說明書。實驗所用一抗為本研究制備的APX多克隆抗體, 二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)(Baiaolaibo,中國)。另外, 本實驗以Actin為內(nèi)參蛋白, 實驗重復(fù)3次, 所用中國綠水螅Actin多克隆抗體為本實驗室自備。在實驗結(jié)束后, 采用Tanon全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Tanon, 中國)對PVDF膜進(jìn)行圖像采集和密度掃描分析。采用SSPS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析, 使用Duncan’s multiple-range test進(jìn)行相對表達(dá)分析,P＜ 0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 中國綠水螅APX基因cDNA序列及DNA序列分析

依據(jù)近緣種APX基因序列設(shè)計引物, 進(jìn)行了3′RACE及5′RACE, 再根據(jù)RACE產(chǎn)物的測序結(jié)果設(shè)計特異性引物通過分子克隆方法克隆了中國綠水螅APX基因cDNA全長序列(GenBank登錄號:KU981066)。中國綠水螅APX基因cDNA序列總長1357 bp, 包括5′非編碼區(qū)107 bp, 3′非編碼區(qū)146 bp及開放閱讀框(Open reading frame, ORF)1104 bp,共編碼367個氨基酸, 預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為40.79 kD,等電點為8.36。BLAST分析顯示中國綠水螅APX氨基酸序列中第50—229位點的區(qū)域?qū)儆谥参镄訟PX結(jié)構(gòu)域同源片段。SOPMA在線分析顯示中國綠水螅APX二級結(jié)構(gòu)組成為α-螺旋占比38.42%, β-折疊15.26%, β-轉(zhuǎn)角6.81%及無規(guī)則卷曲線39.51%?；谥袊G水螅APX氨基酸序列數(shù)據(jù)首先在SWISSMODEL網(wǎng)站上在線篩選用于建模的合適模型(5amm.1.A), 再基于這個模型進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)同源建模和檢驗。該蛋白三級結(jié)構(gòu)主體框架和內(nèi)核主要由α-螺旋構(gòu)成, 而β-折疊主要分布在蛋白質(zhì)的表面(圖 1)。

為探討中國綠水螅APX基因在基因組水平上的基因結(jié)構(gòu), 本研究依據(jù)其cDNA編碼區(qū)兩端序列設(shè)計一對引物(DNA-APX-F及DNA-APX-R, 表 1),以水?？侱NA為模板擴(kuò)增了APX基因DNA序列,PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果表明APX基因在基因組中沒有內(nèi)含子。

2.2 APX蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹的重建

基于中國綠水螅APX氨基酸序列進(jìn)行BLAST分析時發(fā)現(xiàn)與之同源的蛋白質(zhì)序列絕大部分屬于植物界物種, 少數(shù)序列屬于真菌界及動物界(涉及原生動物門、海綿動物門、刺胞動物門、節(jié)肢動物門及腕足動物門)物種。46個代表性同源序列與中國綠水螅APX氨基酸序列比對后進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)生分析, 結(jié)果表明, 以真菌界3個物種APX序列為外群, 植物界物種的APX序列聚為一單系群, 而動物界物種的APX序列聚為另一單系群(圖 2)。

2.3 中國綠水螅APX基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

通過在引物DNA序列中加入酶切位點的方法在中國綠水螅APX基因編碼區(qū)兩端加上酶切位點EcoR Ⅰ及BamHⅠ, 采用重疊延伸PCR方法優(yōu)化了APX基因編碼區(qū)cDNA序列, 再通過分子克隆方法制備了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-GST-APX, 測序及雙酶切方法顯示中國綠水螅APX基因的編碼區(qū)cDNA序列成功插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-GST。原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-GST-APX被轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌表達(dá)菌株E. coliBL21(DE3)中, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)重組融合蛋白GST-APX, 其分子量與預(yù)期大小(69.36 kD)接近, 并且該重組蛋白在誘導(dǎo)溫度為32℃時主要以可溶性形式表達(dá)(圖 3A—E)。先通過親和層析方法純化重組蛋白(圖 3F), 再經(jīng)濃縮后其濃度約為410 μg/mL。重組蛋白N末端10個氨基酸殘基的序列測定結(jié)果(MSPILGYMKI)也直接證實了本研究成功表達(dá)了重組融合蛋白GST-APX。

圖 1 中國綠水螅APX三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig. 1 The deduced tertiary structure of APX from H. sinensis

以上述純化及濃縮后的重組蛋白GST-APX為抗原, 對實驗兔進(jìn)行了4次免疫。以1∶500起始稀釋度按3倍的稀釋倍率逐級稀釋抗血清用于ELISA實驗, 其中以首次免疫之前的兔血清(1∶500稀釋)為陰性對照組, 以第4次免疫后的兔血清(1∶500稀釋)為陽性對照組, 以樣品稀釋液為空白對照組。結(jié)果表明, 得到的兔抗血清效價為1∶1093500(圖 4)。

2.4 中國綠水螅APX基因表達(dá)分析

在不同光照時長梯度(光強(qiáng)度恒定)下培養(yǎng)中國綠水螅30d, qPCR結(jié)果表明, 每天光照0、4h及8h實驗組之間水螅APX基因轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著, 每天光照12h實驗組轉(zhuǎn)錄水平開始明顯升高, 每天光照16h、20h及24h實驗組轉(zhuǎn)錄水平約為每天光照0實驗組的2.5倍(圖 5)。WB檢測結(jié)果表明光照時間較長時(每天光照12h以上)綠水螅APX表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的上調(diào)(圖 6)。

圖 2 基于APX結(jié)構(gòu)域氨基酸序列數(shù)據(jù)重建的ML樹及BI樹Fig. 2 Maximum likelihood tree and Bayesian inference tree based on amino acid sequences of APX domains

3 討論

圖 3 融合蛋白GST-APX的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE of recombinant fusion protein GST-APX

圖 4 基于ELISA方法的融合蛋白GST-APX抗血清效價測定結(jié)果Fig. 4 Titration of antiserum to recombinant fusion protein GSTAPX using indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

圖 5 基于實時定量PCR分析顯示的中國綠水螅在不同光照時長條件下APX基因相對表達(dá)水平Fig. 5 Relative expression levels of APX gene of H. sinensis under different illumination times

圖 6 基于免疫印跡分析顯示的中國綠水螅在不同光照時長條件下APX蛋白表達(dá)模式Fig. 6 APX protein level of H. sinensis under different illumination times

本研究從中國綠水螅中克隆到了APX基因, 該基因共編碼367個氨基酸, 其中長度為180個氨基酸位點的區(qū)域為植物APX蛋白結(jié)構(gòu)域同源片段。目前絕大部分已發(fā)現(xiàn)的APX酶蛋白或APX基因均來自植物界物種[26], 這主要是因為APX生理功能決定的。含有葉綠體的光合生物細(xì)胞中光合氧化碳循環(huán)及光呼吸作用等生理過程的副產(chǎn)物H2O2能引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的氧化性損傷, 而APX能利用抗壞血酸(作為電子供體)、同時協(xié)同AsA-GSH循環(huán)將H2O2還原為H2O, 從而防止H2O2在光合生物體中的毒性堆積, 所以APX是植物細(xì)胞中不可或缺的抗氧化體系重要組成部分[26]。問題是包括本研究實驗材料中國綠水螅在內(nèi)的非植物界的少量物種(主要涉及真菌界及動物界)中也發(fā)現(xiàn)了APX蛋白或APX基因[12, 13], 特別是動物界中的原生動物門、海綿動物門、刺胞動物門、腕足動物門及節(jié)肢動物門等類群的一些物種中發(fā)現(xiàn)了APX基因存在[7](圖 2)。這些動物APX基因的起源及進(jìn)化歷程值得深入探討, 目前有以下3個方面的線索: 首先, APX前體或相關(guān)蛋白的編碼基因可能在早期生命體中普遍存在, 植物類群由于光合氧化碳循環(huán)副產(chǎn)物H2O2的壓力而保留了APX基因, 但大部分動物細(xì)胞由于沒有光合作用產(chǎn)生H2O2的壓力、因而可能在進(jìn)化過程中逐漸舍棄了APX相關(guān)基因。如果是這樣, 海綿和水螅等低等無脊椎動物尚且保留APX基因容易理解, 因為有許多低等無脊椎動物體內(nèi)有單細(xì)胞藻類共生; 但進(jìn)化地位較高等的節(jié)肢動物和腕足動物還保留APX基因可能有特別的原因、或者這些動物類群APX蛋白的功能可能進(jìn)行了相應(yīng)轉(zhuǎn)變, 值得深入探討。

其次, 有觀點認(rèn)為海綿動物和刺胞動物等低等無脊椎動物的祖先可能是許多不同類型單細(xì)胞生物“組合”而成[27], 動物APX基因的起源可能是這些不同單細(xì)胞生物早期融合的結(jié)果。本研究基于APX結(jié)構(gòu)域氨基酸序列重建的系統(tǒng)發(fā)生樹中單細(xì)胞動物和海綿動物聚為一支在一定程度上支持了這個假說(圖 2)。最后, 海綿和水螅等一些低等無脊椎動物細(xì)胞中有單細(xì)胞綠藻共生, 這些動物的APX基因也有可能是從共生綠藻水平轉(zhuǎn)移而來[28]。從基因組擴(kuò)增的中國綠水螅APX基因DNA大小和序列看, 在基因組水平上中國綠水螅APX基因沒有內(nèi)含子, 歐洲綠水螅(H. viridissima)APX基因也沒有內(nèi)含子[15], 而植物APX基因具有內(nèi)含子[29], 共生綠藻APX基因可能是通過RNA途徑水平轉(zhuǎn)移到了水螅細(xì)胞。但綠水螅APX基因不是來自現(xiàn)在的共生綠藻, 因為歐洲綠水螅與其共生綠藻之間APX結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的相似性較低(36%)[15], 這個現(xiàn)象說明綠水螅APX基因的來源及進(jìn)化經(jīng)歷了相當(dāng)復(fù)雜的歷程, 不含共生綠藻的普通水螅(H. vulgaris)具有APX基因也映襯這個推測[14]。值得注意的是, 本研究基于APX結(jié)構(gòu)域氨基酸序列重建的系統(tǒng)發(fā)生樹中植物界物種聚為一單系群, 而動物界物種聚為另一單系群(圖 2), 這說明動物界的APX基因有一共同起源。如果動物中的APX基因真是從共生的植物界物種水平轉(zhuǎn)移而來, 在該系統(tǒng)樹中具有APX基因的動物物種應(yīng)該與植物界物種混雜排列。綜上所述, 從現(xiàn)有證據(jù)看, 動物APX基因的起源目前尚難有定論, 有待進(jìn)一步研究。

為探討中國綠水螅APX蛋白的生理功能, 本研究在不同光照時長梯度下培養(yǎng)中國綠水螅, qPCR和WB檢測結(jié)果均表明光照時間較長時(每天光照12h以上)綠水螅APX表達(dá)呈現(xiàn)一定程度的上調(diào)(圖 5、圖 6)。中國綠水螅是一個由動物與單細(xì)胞綠藻組成的典型共生系統(tǒng)[30], 即每個水螅內(nèi)胚層皮肌細(xì)胞內(nèi)共生20—30個綠藻個體, 宿主細(xì)胞為藻類提供CO2、含氮物質(zhì)、礦物質(zhì)、水及庇護(hù)所, 而綠藻利用光合作用為宿主提供O2、碳水化合物、氨基酸和其他有機(jī)物營養(yǎng)[31, 32]。中國綠水螅原種生活在華南熱帶及靠近熱帶的地區(qū)[30], 水溫較高時水螅的食物水蚤等小型甲殼動物數(shù)量較少, 綠水螅此時面臨食物缺乏的壓力, 在這種情況下水螅體內(nèi)共生綠藻向水螅細(xì)胞輸送的來自光合作用的碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)是綠水螅維持正常生命活動和保持存活的關(guān)鍵。但是, 共生綠藻對于水螅細(xì)胞來說是雙刃劍, 一方面共生綠藻能通過光合作用給水螅細(xì)胞補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì), 另外一方面共生綠藻光合作用產(chǎn)生包括H2O2在內(nèi)的活性氧也能直接危害水螅細(xì)胞, 所以水螅體內(nèi)共生綠藻在長時間光輻射下其連續(xù)進(jìn)行光合作用累積的大量活性氧一部分?jǐn)U散到水螅細(xì)胞內(nèi)[33—35], 此時水螅體內(nèi)表達(dá)上調(diào)的APX可能參與清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧。

致謝：

感謝深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院汪安泰先生協(xié)助采集實驗材料。