周炎，楊惠娟，史宏志，王景，張玉寧

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國家煙草栽培生理生化基地，河南鄭州 450002

氮素對煙草的生長發(fā)育及其產(chǎn)量品質(zhì)有著重要影響。硝酸還原酶（NR）是植物氮代謝中硝酸鹽還原的限速酶和調(diào)節(jié)酶，與 NO3- 的積累關(guān)系密切，直接影響到植物氮肥的利用率，在植物氮代謝過程中具有重要作用[1-4]。煙草硝酸還原酶基因NIA（nitrate reductase [NADH]）分為NIA1和NIA2，分別來自普通煙草的父本和母本。研究發(fā)現(xiàn)，NR 積累量和活性會影響植株生長情況和硝酸鹽含量，NIA基因的高表達(dá)也可增加種子蛋白質(zhì)的積累量[5-7]，從而直接或間接地影響煙草的品質(zhì)和安全性。

轉(zhuǎn)錄因子（Transcriptional Factors）是一類可與啟動子結(jié)合并相互作用的蛋白，在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中起到了重要作用[8-9]，功能上可大體分為激活型和抑制型，可調(diào)控特定基因的表達(dá)。酵母單雜交系統(tǒng)是一種篩選DNA互作蛋白的有效方法，其突出特點(diǎn)是可在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核細(xì)胞的DNA與蛋白質(zhì)間相互作用，并通過篩選cDNA文庫直接得到與靶序列相互作用的蛋白質(zhì)基因序列[10-12]。酵母單雜交系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄因子的篩選上得到了較為廣泛的應(yīng)用[13]，在煙草中的應(yīng)用多集中在抗逆性方面，有研究利用酵母單雜交技術(shù)在煙草中篩選出了與DRE順式元件結(jié)合的抑制型DREBP類轉(zhuǎn)錄因子[14-15]。而針對NIA基因的互作蛋白研究尚不多見。篩選NIA啟動子序列的互作蛋白可為其轉(zhuǎn)錄因子的研究奠定基礎(chǔ)，從而更好地調(diào)控NIA的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)在于NIA1啟動子互作蛋白的篩選。通過克隆煙草硝酸還原酶基因NIA1的啟動子，構(gòu)建煙草cDNA基因表達(dá)文庫，并進(jìn)行酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，旨在篩選NIA1啟動子的互作蛋白，為硝酸還原酶基因的表達(dá)調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)體系采用 Clontech 公司的Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System。所用菌株為 Y1HGold，pAbAi 質(zhì)粒用于構(gòu)建誘餌載體，pGADT7-Rec AD 質(zhì)粒用于 cDNA 文庫篩選，均購自 Clontech 公司。所用試劑盒：Yeastmaker Yeast Transformation System 2、 Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System、 Easy Yeast Plasmid Isolation Kit；所用試劑：Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 / Mix 2、金擔(dān)子素 A（aureo-basidin A，AbA）均購自 Clontech 公司；大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒購自 OMEGA 公司；DNA marker 購自 Biomed 公司；限制性內(nèi)切酶購自 TaKaRa 公司；所用到的抗生素為氨芐西林（Ampicillin，Amp）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）和金擔(dān)子素 A（aureo-basidin A，AbA）。

實(shí)驗(yàn)用K326煙株為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草栽培生理實(shí)驗(yàn)室培育，用于構(gòu)建煙草cDNA文庫。PCR產(chǎn)物測序在北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 NIA1上游啟動子區(qū)域的克隆與誘餌序列的獲得

在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到煙草氮代謝關(guān)鍵酶NIA1基因（Nicotiana tabacum nia-1 gene for nitrate reductase （EC 1.6.6.1），X14058.1），經(jīng)過生物信息學(xué)分析，截取ATG上游938bp的堿基序列，設(shè)計引物，以煙草基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得片段，上游引物為NIA1-F：TATATATATGACCCTGCAATGAAAG；下游引物為NIA1-R：AGATTATTCTAAAAAAGAAAGAGAGAT。獲得片段后進(jìn)行測序，鑒定序列是否與目的片段一致，利用啟動子在線分析網(wǎng)站plantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析獲得片段。

1.3 運(yùn)用SMARTTM技術(shù)構(gòu)建煙草K326品種cDNA文庫

選取不同發(fā)育時期的K326植株，將根、莖、葉、花各組織以液氮速凍，提取各組織RNA進(jìn)行混合，純化總RNA后富集poly A+ mRNA，利用SMART技術(shù)和DSN酶，參照說明書構(gòu)建煙草歸一化cDNA表達(dá)文庫。

1.4 誘餌載體的構(gòu)建與誘餌報告菌株的獲得

采用 Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System 提供的表達(dá)載體pAbAi，以XhoⅠ和HindⅢ分別雙酶切NIA1啟動子序列與表達(dá)載體pAbAi，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，用T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用含氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后進(jìn)行電泳鑒定。取酶切片段長度正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。

參照 Yeastmaker Yeast Transformation System2 說明書將誘餌載體轉(zhuǎn)入Y1HGold菌株，轉(zhuǎn)化液涂布于 SD/-Ura 固體培養(yǎng)基上，3d后挑取單克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.5 報告基因本底表達(dá)水平的測定

金擔(dān)子素A（AbA）能高效抑制酵母細(xì)胞的生長，而 pAbAi 載體上含有 AbA 的抗性基因 AUR1-C。一旦有蛋白與 pBait-AbAi 上的誘餌序列結(jié)合便可使酵母產(chǎn)生 AbA 抗性，從而篩選出陽性菌落，確定目標(biāo)文庫質(zhì)粒。進(jìn)行文庫篩選前必須先確定 AbA 最低抑制濃度即報告基因的本底表達(dá)水平，以排除酵母內(nèi)源誘餌結(jié)合蛋白的干擾。

挑取 SD/-Ura培養(yǎng)皿上正常生長的誘餌菌株，將其懸浮于 0.9%的 NaCl 中，將 OD600值調(diào)至約0.002 后涂布在分別含 0、200、400至 1000 ng/mL AbA 的 SD/-Ura 固體培養(yǎng)基上，將完全抑制菌落生長的最低 AbA 濃度確定為文庫篩選時使用的 AbA濃度。

1.6 酵母單雜交文庫的構(gòu)建和初步篩選

將純化的雙鏈 cDNA 和線性化的 pGADT7-Rec表達(dá)載體混合，按照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 的使用說明共轉(zhuǎn)化誘餌酵母。將酵母細(xì)胞懸液分別稀釋至1/10、1/100、1/1000 和 1/10000，各取100 μL 稀釋液分別涂布在 SD/-leu 平板上，用于計算篩選的總克隆數(shù)。將剩余的約 15 mL 酵母細(xì)胞懸液按200 μL/皿涂布在對應(yīng)濃度的 SD/-leu/AbA 平板上，進(jìn)行陽性克隆的初步篩選。3～5 d 后統(tǒng)計 SD/-leu 平板上的克隆數(shù)，用于計算總克隆數(shù)，總克隆數(shù)須大于1.0×106。

總克隆數(shù)=cfu/涂板體積×稀釋率×細(xì)胞懸液總體積。

1.7 陽性互作的鑒定

挑取 SD/-leu/AbA 平板上健康的單克隆，重新點(diǎn)在含AbA的SD/-leu培養(yǎng)基上，3～5天后挑取健康菌落重復(fù)這一驟。挑取最終在SD/-leu/AbA平板上生長的菌落，采用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 進(jìn)行酵母菌落PCR，取少量產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，將條帶明亮的PCR產(chǎn)物送至公司測序，以T7為引物。數(shù)據(jù)返回后對序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。選取有生物學(xué)意義的序列，采用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit提取與其編號對應(yīng)菌落的質(zhì)粒并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 NIA1基因啟動子的克隆

根據(jù)選取的煙草NIA1基因上游序列設(shè)計引物 ,通過 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，其長度與目標(biāo)長度相符（圖1），測得結(jié)果表明目標(biāo)序列已成功克?。▓D2）。將序列在plantCARE網(wǎng)站上進(jìn)行分析，結(jié)果表明，目標(biāo)序列中含有多個典型的真核生物啟動子順式元件如CAAT-box、TATA-box 等，還存在多種響應(yīng)元件如GA-motif、GARE-motif，符合啟動子基本特征。

圖1 NIA1基因啟動子片段PCR克隆電泳圖Fig.1 Electrophoretic diagram of cloned NIA1-promoter region

圖2 NIA1基因啟動子片段克隆測定序列Fig.2 Sequencing results of cloned NIA1-promoter fragment

2.2 誘餌報告菌株的轉(zhuǎn)染與鑒定

將誘餌載體pAbAi-P:NIA1各自轉(zhuǎn)入Y1HGold菌株，菌落PCR鑒定結(jié)果顯示片段長度與理論值（1.35 kb+插入片段長度）相符，說明誘餌載體已成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞（圖3）。

2.3 誘餌報告菌株的AbA背景抑制濃度測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖4），NIA1誘餌菌株在400 ng/mL的AbA濃度下已無菌落生長。因此，最終文庫篩選時NIA1誘餌菌株所用培養(yǎng)基的AbA濃度為400 ng/mL。

2.4 煙草K326 cDNA文庫構(gòu)建結(jié)果

煙草cDNA文庫電泳鑒定結(jié)果（圖5）中可以看出，條帶呈彌散狀且分布均勻，表明煙草全基因歸一化表達(dá)文庫構(gòu)建成功，可以用于酵母單雜交實(shí)驗(yàn)篩選。

圖3 陽性誘餌菌株的鑒定Fig.3 Identification of positive bait colony

圖4 AbA最低抑制濃度的鑒定Fig.4 Identification of the minimum inhibitory concentration of AbA

圖5 cDNA文庫電泳圖Fig.5 Electrophoretic diagram of cDNA library

2.5 酵母單雜交文庫互作蛋白的初步篩選結(jié)果

酵母但雜交文庫總克隆數(shù)為4.6×106（圖6），滿足要求。對陽性克隆進(jìn)行菌落 PCR，結(jié)果表明（圖7）插入片段長度分布在200 bp ～ 2000 bp之間，說明構(gòu)建的文庫容量和質(zhì)量符合要求。

將上述PCR產(chǎn)物測序進(jìn)行同源性比對，篩選出 9個有生物學(xué)意義的基因序列（表1），并分別對其進(jìn)行電泳驗(yàn)證（圖8）。

圖6 文庫篩選菌落生長情況Fig.6 Colony growth oflibrary screening

圖7 NIA1啟動子區(qū)域酵母單雜交篩庫部分備選菌落的PCR結(jié)果Fig.7 PCR results of certain colonies in yeast one hybrid library of NIA1 promoter region

圖8 NIA1啟動子片段酵母單雜交文庫篩選結(jié)果Fig.8 Screening results of NIA1 promoter fragment in yeast one hybrid library

表1 NIA1啟動子序列轉(zhuǎn)錄因子篩選結(jié)果Tab.1 NIA1 promotor transcription factor screening results

3 討論

本研究利用Clontech公司提供的酵母單雜交文庫篩選系統(tǒng)構(gòu)建了硝酸還原酶基因NIA1啟動子區(qū)域的酵母單雜交文庫，并篩選出 9 個來自煙草屬的基因序列。其中，功能較為明確的蛋白有2個，分別是含有CRM（The chloroplast RNA splicing and ribosome maturation）結(jié)構(gòu)域的CFM3蛋白（No.71）和亞硫酸鹽氧化酶類似蛋白（No.126，Sulfite oxidase-like，SO）。其余蛋白功能尚不明確，但通過其結(jié)構(gòu)域可對部分蛋白的功能進(jìn)行推測。如No.51是未知線粒體類似蛋白、No.68含有胃蛋白酶類似結(jié)構(gòu)域等。No.95是CMSS1轉(zhuǎn)錄變異體，含有p-環(huán)NTP酶結(jié)構(gòu)域，其特點(diǎn)是具有Walker A和Walker B基序，可以分別與核苷酸的磷酸基團(tuán)和Mg2+結(jié)合，目前研究已知P環(huán)NTP酶類在植物抗病方面發(fā)揮了重要作用[17]。

篩選得到的No.71（XP_016503563.1）蛋白與煙草中的預(yù)測蛋白CFM3有同源性，含有CRM結(jié)構(gòu)域。已有研究發(fā)現(xiàn)，植物葉綠體中含有CRM結(jié)構(gòu)域的蛋白能夠與RNA結(jié)合，并參與對內(nèi)含子的剪接[16]。RNA結(jié)合蛋白往往在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中扮演重要角色，某些具有特殊結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白也可作為轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合[17]。有研究指出，CRM結(jié)構(gòu)域也許能夠在一定程度上特異地與催化性RNA互作[18]。目前已發(fā)現(xiàn)CFM3蛋白不僅作用于葉綠體group II內(nèi)含子的剪接，也參與了線粒體基因的表達(dá)及其他一些植物和細(xì)菌的生命過程[19]。因此，煙草CFM3類似蛋白也有可能以某種形式參與了煙草NIA1啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

No.126（NP_001312236.1）是普通煙草中的亞硫酸鹽氧化酶類似蛋白SO。SO是如今發(fā)現(xiàn)的4種鉬酶中分子量最小的一種，其 N 端含有鉬輔因子（molybdenum cofactor，Moco）結(jié)構(gòu)域，在高等植物種廣泛分布且高度保守。有研究認(rèn)為，植物的SO和NR有相當(dāng)大的同源性，說明它們可能來自于一個共同的家族[20]。植物SO定位于植物過氧化物酶體，研究發(fā)現(xiàn)所有SO蛋白質(zhì)的C端都含有一個過氧化酶體定位序列（peroxismal targeting sequence，PTS）[21-22]，試驗(yàn)表明，PTS 能夠引導(dǎo)多肽進(jìn)入植物、動物和酵母的過氧化物酶體中。但其對硝酸還原酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的影響尚需進(jìn)一步研究。