葉建斌，王璐，楊峰，閆記，楊雪鵬，馬科，樊新順，田曉輝，郝輝，毛多斌，張展

1 鄭州輕工業(yè)學(xué)院，鄭州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道166號(hào) 450001；

2 河南省中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市隴海東路72號(hào) 450000；

3 河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司，河南省許昌市金葉大道666號(hào) 461000

再造煙葉是利用煙草廢棄物資源重組加工制成的煙草薄片，是卷煙不可或缺的重要原料。提升再造煙葉品質(zhì)，對(duì)于充分利用煙草資源、改善卷煙感官質(zhì)量具有重要意義[1-2]。生產(chǎn)中通常將煙草原料浸提液濃縮后涂布于再造煙葉表面，從而賦予其豐富的煙草香氣。因此，浸提液的優(yōu)劣直接影響再造煙葉感官風(fēng)格和品質(zhì)。

生物發(fā)酵技術(shù)具有綠色安全、低耗高效等特點(diǎn)，對(duì)于改善再造煙葉品質(zhì)具有重要作用[3]。當(dāng)前，許多研究人員嘗試?yán)妹钢苿┗蛭⑸飳?duì)浸提液進(jìn)行發(fā)酵處理，改善再造煙葉品質(zhì)。朱國成等[4]采用淀粉酶、糖化酶以及纖維素酶對(duì)薄片原料（煙梗、煙末）進(jìn)行處理，考察了浸提液中糖類物質(zhì)的變化。吳亦集等[5]利用蛋白酶、果膠酶和半纖維素酶處理煙梗和煙末浸提液，考察了其對(duì)還原糖和氨基酸含量的影響。張勃等[6]采用從煙葉表面分離的兩株菌株對(duì)煙梗水提物進(jìn)行發(fā)酵處理，發(fā)現(xiàn)處理后再造煙葉的致香組分增加，感官品質(zhì)改善。這些生物處理手段，可以促進(jìn)大分子物質(zhì)降解、降低雜氣，同時(shí)糖和氨基酸等在處理過程中會(huì)通過美拉德反應(yīng)生成大量致香物質(zhì)，有利于煙葉品質(zhì)的改善。然而目前微生物技術(shù)在煙草中應(yīng)用的研究仍十分有限，煙草中豐富的微生物資源有待進(jìn)一步挖掘。

類芽孢桿菌廣泛存在于土壤和煙草表面[7-8]，但是少有利用該類微生物發(fā)酵煙草原料浸提液的相關(guān)報(bào)道。本課題組前期從煙葉表面分離獲得了一株類芽孢桿菌，可利用煙草浸提液生長，適應(yīng)性良好[9]。研究中發(fā)現(xiàn)該菌株處理的浸提液香氣良好，可能有利于改善再造煙葉品質(zhì)。因此，本研究收集該微生物的靜息細(xì)胞用于發(fā)酵再造煙葉原料浸提液，重點(diǎn)考察發(fā)酵過程中浸提液內(nèi)蛋白質(zhì)、氨基酸、糖等物質(zhì)含量的變化，并對(duì)成品再造煙葉熱裂解主要致香成分進(jìn)行分析，結(jié)合感官評(píng)價(jià)開展再造煙葉應(yīng)用效果驗(yàn)證，旨在為利用生物技術(shù)改善再造煙葉品質(zhì)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試煙末、煙梗、碎煙片混合物由河南中煙許昌薄片廠提供。類芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)室從煙葉表面分離并鑒定的菌株[9]。

LB固體培養(yǎng)基（商品化試劑）、二氯甲烷（≥99%）、乙酸苯乙酯（99.5%）、無水硫酸鈉（分析純）（北京百靈威科技有限公司）；硫酸鉀、次氯酸鈉、水楊酸鈉、酒石酸鉀鈉、聚乙氧基月桂醚、磷酸氫二鈉，以上試劑均為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

Agilent 6890-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；CDS5200熱裂解儀（美國CDS公司）；AA3-連續(xù)流動(dòng)分析儀（德國布朗盧比公司）；KL512J數(shù)控恒溫水浴鍋（上海鴻經(jīng)生物儀器制造有限公司）；BLBIO-5GC自動(dòng)發(fā)酵罐（上海百侖生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 原料浸提液制備

原料浸提液制備：準(zhǔn)確稱取0.5 kg煙末、煙梗及碎煙片（混合物），加入3 kg熱水，于 55℃下浸取1 h，過濾，獲得浸提液。

1.2.2 浸提液發(fā)酵

1.2.2.1 靜息細(xì)胞的制備

采用LB培養(yǎng)基將類芽孢桿菌培養(yǎng)到OD600值為1.2左右停止（此時(shí)細(xì)胞濃度約為109個(gè)細(xì)胞/mL），離心去掉培養(yǎng)基，收集細(xì)胞置于pH為7.2的PBS緩沖液中，作為靜息細(xì)胞備用。

1.2.2.2 發(fā)酵處理

取2 kg浸提液置于自動(dòng)發(fā)酵罐中，加入0.2 g類芽孢桿菌靜息細(xì)胞，控制在30 ℃，150 r/min，pH 6.0，溶氧25%條件下發(fā)酵。間隔一定時(shí)間，取樣分析。實(shí)際生產(chǎn)中，浸提液通常存放5 h以內(nèi)[10]。因此，為滿足工業(yè)生產(chǎn)需求并最大限度考察類芽孢桿菌對(duì)浸提液的作用效果，將發(fā)酵時(shí)間控制在5 h。

1.2.2.3 對(duì)照樣品發(fā)酵

對(duì)照發(fā)酵樣品是將浸提液采用上述相同條件處理，但不加入類芽孢桿菌靜息細(xì)胞。

1.2.3 浸提液分析

1.2.3.1 氨基酸、糖和蛋白質(zhì)的測定

浸提液中的總游離氨基酸、還原糖含量的測定分別依照標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T8314-87《茶游離氨基酸總量測定》[11]、YC/T159-2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續(xù)流動(dòng)法》[12]。蛋白質(zhì)含量的檢測按照文獻(xiàn)Bradford法進(jìn)行[13]。每個(gè)檢測過程重復(fù)3次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.2.3.2 揮發(fā)性香味成分的測定

樣品前處理：取發(fā)酵后浸提液200 mL，同時(shí)蒸餾萃取2 h，萃取液中加入12 g無水硫酸鈉，于室溫放置過夜， 55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾至氣相瓶，待測。

色譜柱： HP-5MS（60m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣流速：1.0 mL/min；分流比：10:1；進(jìn)樣量：2 μL；程序升溫條件：柱初溫70 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至175 ℃，保持20 min，再以1 ℃/min升至220 ℃，保持20 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊源（EI），電子能量: 70 eV，離子源溫度：230 ℃，傳輸線溫度：240 ℃，四級(jí)桿溫度: 150 ℃，質(zhì)譜掃描范圍: 50～450 u。利用Nist數(shù)據(jù)庫對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析，以乙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析，每個(gè)樣品平行做2次，求平均值。

1.2.4 再造煙葉樣品分析

1.2.4.1 再造煙葉樣品制備

在55 ℃將浸提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到26波美，涂布到再造煙葉基片上，控制涂布率39%，得到涂布再造煙葉樣品。將樣品在22 ℃，空氣濕度65%的恒溫恒濕箱中，平衡48 h后備用。

1.2.4.2 再造煙葉樣品熱裂解產(chǎn)物分析

稱取樣品2 mg放入裂解儀進(jìn)行裂解分析，裂解產(chǎn)物直接導(dǎo)入GC/MS進(jìn)行分離鑒定。熱裂解氛圍：大氣環(huán)境，熱裂解探頭初始溫度：50 ℃，以20 ℃/ms升溫速度升至700 ℃，并保持10 s。

色譜柱： DB-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；載氣：氦氣，99.999%；流速：1 mL/min；分流比50:1；程序升溫：50 ℃保持1 min，3 ℃/min升至120 ℃，保持1 min，5 ℃/min升至250 ℃，保持20 min；離子源：電子轟擊源（EI）；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；質(zhì)譜掃描范圍50～450 u。通過NIST11譜庫比對(duì)，已匹配度≥80%者定性；采用峰面積歸一化法定量，以各化合物色譜峰面積的相對(duì)百分比表示其相對(duì)含量。

1.2.5 感官評(píng)價(jià)

將平衡后的再造煙葉切絲卷制成卷煙進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)由9位專業(yè)評(píng)吸員完成，參照YC/T498-2014再造煙葉（造紙法）感官評(píng)價(jià)方法[14]，執(zhí)行河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 浸提液發(fā)酵過程中的組分變化

2.1.1 蛋白質(zhì)總量的變化

浸提液發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)總量的變化如圖1所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，浸提液中蛋白質(zhì)含量有所減少。其中，在類芽孢桿菌發(fā)酵（Cell組）的原料浸提液中蛋白質(zhì)降解速率和最終降解量均高于對(duì)照組（CK組）的浸提液。Cell組和CK組的浸提液中起始的蛋白質(zhì)含量接近，分別為6.40 mg/mL、6.32 mg/mL，經(jīng)過5 h發(fā)酵，Cell組的浸提液中蛋白質(zhì)減少為4.06 mg/mL，降解率為36.6%， CK組的浸提液中蛋白質(zhì)減少為5.04 mg/mL，降解率為19.6%。

2.1.2 游離氨基酸總量的變化

發(fā)酵過程中氨基酸濃度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢（圖2）。2組浸提液中的最高值均出現(xiàn)在發(fā)酵3.5 h，其中Cell組中氨基酸的峰值（124.4 μg/mL）是CK組（63.3 μg/mL ）的2倍左右。在發(fā)酵3.5 h后，2組發(fā)酵液中氨基酸濃度均呈下降趨勢， Cell組浸提液中的氨基酸濃度從最高峰減少到70.2 μg/mL ，CK組中則減少到45.6 μg/mL。

2.1.3 可溶性還原糖總量的變化

浸提液發(fā)酵過程中2組浸提液中的可溶性還原糖含量均表現(xiàn)出降低的趨勢（圖3），但Cell組的變化趨勢要大于CK組。比較2組發(fā)酵液可知，CK組的還原糖從21.0 mg/mL減少到17.2 mg/mL，降解率為18.1%；而Cell組則從21.3 mg/mL減少到了14.8 mg/mL左右，降解率為30.5%。

2.2 浸提液致香成分

根據(jù)上述結(jié)果，3.5 h時(shí)Cell組和CK組浸提液中的氨基酸濃度達(dá)到最高，推測為微生物的最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)。因此，為了研究微生物發(fā)酵對(duì)浸提液化學(xué)成分的影響，利用同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合GC-MS方法對(duì)發(fā)酵3.5 h后的浸提液中的致香成分進(jìn)行分析。2組樣品中共檢測出88種致香成分，其中CK組檢測出48種致香成分，Cell組檢測出83種，按官能團(tuán)進(jìn)行了分類，結(jié)果見附表1（因版面原因不在紙質(zhì)版刊登，詳見電子版）。

圖1 蛋白質(zhì)含量變化情況Fig.1 Changes of protein content

圖2 氨基酸含量變化情況Fig.2 Changes of amino acid content

圖3 可溶性還原糖含量的變化情況Fig.3 Changes of soluble reducing sugar content

對(duì)香味成分歸類后發(fā)現(xiàn)，Cell組中的致香物質(zhì)種類和部分物質(zhì)的含量均有明顯提高。結(jié)果顯示酮類和烴類增幅最為明顯，酸類和酯類次之，分別增加了10種、8種和7種、5種。如Cell組中愈創(chuàng)木烯為1.1384 μg/mL、茶香酮為1.0089 μg/mL、（1S,2E,4S,5R,7E,11E）-西松烷基-2,7,11-三己烯-4,5-二醇為0.5747 μg/mL，但這些均未在CK組中檢出。這些特征香味物質(zhì)都是煙草中重要的香味成份，對(duì)于煙草感官品質(zhì)具有重要的影響[15]。

值得注意的是，Cell組中增加最為明顯的是糠醛、糠酮類美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。該類化合物經(jīng)微生物發(fā)酵的原料浸提液中總含量達(dá)到1.1811 μg/mL，要遠(yuǎn)高于CK組中的0.3737 μg/mL。Cell組中最高的是5-甲基糠醛，含量為0.5539 μg/mL，而CK組則未檢出。2-乙基呋喃在Cell組中（0.2351 μg/mL）的含量則是CK組（0.0337 μg/mL）的6倍多。

在其他類型的香味物質(zhì)中，CK組與Cell組的含量差異不大。如CK組中巨豆三烯酮的含量為0.9374 μg/mL，在Cell組中含量也為0.9370 μg/mL。醇類化合物中，Cell組和CK組中含量最高的均為金合歡醇，分別為0.6803 μg/mL和0.6782 μg/mL。酯類化合物中，二氫獼猴桃內(nèi)酯在兩組發(fā)酵液中都是主要的香味成分，分別為0.6548 μg/mL（Cell組）和0.6326 μg/mL（CK組）。酚類化合物中，兩組均以4-乙烯基愈創(chuàng)木酚為主要成分，含量分別為0.2481 μg/mL（Cell組）和0.2324 μg/mL（CK組）。在N雜環(huán)類化合物中，Cell組和CK組的煙堿含量分別為0.9826 μg/mL和0.9285 μg/mL，占該類香味成分的一半左右，說明該微生物發(fā)酵并沒有降低發(fā)酵浸提液中的煙堿類物質(zhì)。

2.3 再造煙葉樣品熱裂解產(chǎn)物

為了確定微生物發(fā)酵浸提液對(duì)成品再造煙葉品質(zhì)的影響，將發(fā)酵后的浸提液濃縮后涂布到再造煙葉片基上，通過熱裂解質(zhì)譜儀模擬進(jìn)行燃燒分析比較了兩組再造煙葉樣品熱裂解產(chǎn)物的差異，結(jié)果見附表2（因版面原因不在紙質(zhì)版刊登，詳見電子版）。

熱裂解結(jié)果顯示Cell組涂布制備的再造煙葉熱裂解產(chǎn)物中的致香物質(zhì)種類和相對(duì)含量均有明顯提高。雖然Cell組中少部分香味物質(zhì)的峰面積百分比表現(xiàn)出了減少，如減少較為明顯的包括1-甲氧基-2-甲基-3-丁烯、4-環(huán)戊烯-1,3-二酮、4-乙基環(huán)己酮、3-羥基丁酸甲酯、2-甲基丙酸等。但將熱裂解產(chǎn)物進(jìn)行歸類后，發(fā)現(xiàn)大部分香味物質(zhì)的總體含量都有所增加，包括烴類、酮類、醇類、N雜環(huán)類、酸類、糠醛糠酮類、酚類等香味物質(zhì)。

與CK組相比，Cell組中典型煙氣香味物質(zhì)均有所提高。如烴類香味物質(zhì)增加最高的是檸檬烯，從0.8436%增加到1.2898%。酮類化合物中，羥基丙酮從2.2193%增加到3.0128% 。酯類化合物中， Cell組中γ-丁內(nèi)酯的色譜峰面積相對(duì)百分比為0.5515%，而CK組中未檢出。乙酸則是酸類成分中增加最為顯著的物質(zhì)，從2.1378%增加到3.1472% 。在糠醛糠酮類化合物中，增加最高的香味物質(zhì)是2,3-二氫-5-甲基呋喃，在Cell組中該化合物的色譜峰面積的相對(duì)百分比為0.4725%，而CK組中未檢測到。另一種增加較為明顯的是糠醛，在Cell組和CK組中的色譜峰面積的相對(duì)百分比分別為1.4839%和1.0861%，煙氣中的糠醛可以使卷煙表現(xiàn)出明顯的焦甜或烤甜味[15]。

2.4 再造煙葉感官品質(zhì)

為了確定微生物發(fā)酵原料浸提液可以提升成品再造煙葉的品質(zhì)，進(jìn)行了涂布發(fā)酵（Cell組）和未發(fā)酵浸提液（CK組）再造煙葉樣品感官品質(zhì)的差異比較，結(jié)果表明（表1），與CK組樣品相比，Cell組的成品再造煙葉香氣指標(biāo)顯著改善，主要表現(xiàn)為香氣質(zhì)和香氣量增加，香氣更加豐富。此外，Cell組產(chǎn)品的灼燒感和殘留也有所改善，煙氣更加細(xì)膩柔和圓潤，其他指標(biāo)變化不明顯。發(fā)酵液涂布的產(chǎn)品總體感官得分由76.5分提高至78.8分，說明采用發(fā)酵涂布液促進(jìn)了再造煙葉感官質(zhì)量的提升。

表1 再造煙葉感官評(píng)吸結(jié)果Tab.1 Sensory evaluation results of reconstituted tobacco

3 討論

本研究表明浸提液在發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)和還原糖逐漸減少，而氨基酸呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。這可能因?yàn)闊煵萁嵛镒陨砀缓罅课⑸颷16]，在放置過程中存在發(fā)酵作用，故蛋白質(zhì)、糖類逐漸較少。在發(fā)酵前期，氨基酸濃度的增加可能與蛋白質(zhì)降解相關(guān)；在發(fā)酵后期，氨基酸濃度的減少可能與美拉德反應(yīng)有關(guān)，也可能是部分氨基酸被微生物作為氮源進(jìn)一步消耗掉。

本課題組前期研究證明[9]，類芽孢桿菌被證明對(duì)煙草浸提液具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，能夠在高還原糖濃度下有效降解浸提液中甾醇類化合物生成相應(yīng)的酸類和小分子糖類物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，利用類芽孢桿菌靜息細(xì)胞發(fā)酵浸提液，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的降解，從而使發(fā)酵液中的氨基酸濃度明顯增加。有相關(guān)研究報(bào)道了煙草中的游離氨基酸含量[17-18]，但未見報(bào)道微生物發(fā)酵如何影響煙草浸提液氨基酸含量的變化。發(fā)酵過程中，還原糖含量的變化可能與如下幾個(gè)因素相關(guān)：（1）微生物生長消耗還原糖；（2）還原糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)；（3）大分子物質(zhì)酶解或水解產(chǎn)生還原糖。本研究中，類芽孢桿菌靜息細(xì)胞發(fā)酵浸提液雖然可以降解部分甾醇生成糖類物質(zhì)，但由于該類底物含量較低，因此還原糖含量總體呈現(xiàn)下降趨勢。

本研究表明類芽孢桿菌發(fā)酵浸提液中的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物明顯增加。結(jié)合2組發(fā)酵液氨基酸濃度的差異，可初步推測這些美拉德反應(yīng)產(chǎn)物與浸提液中氨基酸濃度的增加有一定的關(guān)聯(lián)。綜合分析結(jié)果表明，類芽孢桿菌靜息細(xì)胞發(fā)酵可促進(jìn)蛋白質(zhì)降解生成氨基酸，而增加的氨基酸可能與發(fā)酵液中的糖類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而推動(dòng)了體系中的美拉德反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了浸提液中香味物質(zhì)的增加。Cell組浸提液中，其他香味物質(zhì)的增加機(jī)理仍不明確，后期應(yīng)進(jìn)一步探索類芽孢桿菌是否可以降解煙草浸提液中的其他大分子物質(zhì)，如果膠或少量可溶性纖維素。

本研究表明Cell組發(fā)酵浸提液制備的再造煙葉裂解產(chǎn)物中香味成份含量有所增高且感官品質(zhì)也有所提升?？赡芤?yàn)榻嵋涸?5℃下真空旋蒸[10]濃縮過程中一些小分子物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成部分致香前體物質(zhì)，從而使得再造煙葉熱裂解產(chǎn)物中香味物質(zhì)有所增加。因此，添加類芽孢桿菌靜息細(xì)胞發(fā)酵浸提液可促進(jìn)部分小分子物質(zhì)的生成，從而有利于促進(jìn)濃縮過程致香前體物質(zhì)的生成。因熱裂解反應(yīng)較為復(fù)雜，本研究尚無法客觀評(píng)價(jià)致香物質(zhì)的增加與具體哪些前體物質(zhì)相關(guān)。但感官評(píng)價(jià)對(duì)比結(jié)果顯示Cell組再造煙葉的香氣明顯增加，驗(yàn)證了裂解產(chǎn)物中香味物質(zhì)的增加對(duì)于內(nèi)在品質(zhì)的提升效果。

4 結(jié)論

本研究利用一株從煙草原料中分離的類芽孢桿菌發(fā)酵再造煙葉原料浸提液并開展化學(xué)分析和感官評(píng)價(jià)，得到主要結(jié)論如下：

（1）與未添加微生物的浸提液相比，在發(fā)酵過程中添加類芽孢桿菌靜息細(xì)胞具有輔助降解浸提液中蛋白質(zhì)的作用，蛋白質(zhì)降解速率快，最終蛋白質(zhì)含量少。

（2）類芽孢桿菌靜息細(xì)胞發(fā)酵可以促進(jìn)浸提液中氨基酸和還原糖的反應(yīng)，從而提高浸提液中香味成分種類和含量的增加。

（3）經(jīng)類芽孢桿菌靜息細(xì)胞發(fā)酵的浸提液中香味物質(zhì)的增加以美拉德產(chǎn)物為主，包括糠醛、5-甲基糠醛、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2-乙基呋喃。

（4）涂布類芽孢桿菌發(fā)酵浸提液獲得的再造煙葉裂解產(chǎn)物中香味成份含量有所增高，最終感官品質(zhì)有所提升。