梁彩鳳，劉建勇

(廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江，524088)

日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)是中國主要養(yǎng)殖對蝦之一，其不僅耐低溫、耐干能力強，且肉質(zhì)鮮美、價格高，市場前景廣闊[1-4]。目前，苗種生產(chǎn)所用的種蝦絕大部分選自野生群體，未經(jīng)嚴格的種質(zhì)篩選與改良，所培育的苗種普遍存在生長較慢、發(fā)病率和死亡率高、抗逆性較差、養(yǎng)殖收益欠佳等問題，嚴重制約了日本囊對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[5-6]。水體pH是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的環(huán)境因子之一，pH變化不僅改變氨氮、亞硝酸鹽等環(huán)境因子間接影響生物生存，還直接對水產(chǎn)動物的代謝機能產(chǎn)生影響，顯著影響水產(chǎn)動物的遺傳基礎、抗病力以及病原微生物的致病力[7-8]。近年來，由于酸雨和水污染影響，導致養(yǎng)殖水體pH波動較大[9]，開展魚蝦類有關pH脅迫的研究越來越受到國內(nèi)外學者的重視[10-13]。已有研究表明，低pH脅迫對甲殼動物生長代謝[14]、存活[15]、抗氧化應激[16]和免疫防御[17-20]等方面的影響均十分顯著，且不同種類影響程度存在明顯差異。在低pH脅迫對蝦類的毒性研究方面，中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)[21]、日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)[22]、凡納濱對蝦(Ltopenaeusvannamei)[23]和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[9]等研究較多，有關日本囊對蝦耐低pH脅迫的研究較少。

對日本囊對蝦的耐低pH脅迫開展初步研究，以確定pH對日本囊對蝦的半致死摩爾濃度和半致死時間，為日本囊對蝦的養(yǎng)殖及耐低pH品系選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 日本囊對蝦

試驗在廣東湛江國聯(lián)水產(chǎn)開發(fā)股份有限公司雷州市紀家二場進行。所用日本囊對蝦親本引自中國臺灣海峽海域群體而培育的第3世代選育群體(G3群體)，120日齡，隨機挑選健康活潑、規(guī)格整齊，平均體長(48.87±4.81) mm、腹節(jié)長(34.00±3.56) mm、體質(zhì)量(1.35±0.38) g的幼蝦420尾。其中，60尾用于預試驗，360尾用于正式試驗。試驗前將全部對蝦在試驗池(面積25 m2，水深20 cm，底部未鋪沙)暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間少量投飼，試驗前饑餓處理24 h。

1.1.2 主要藥品與設備

HCl分析純；NaOH分析純。ATAGO手持式鹽度計(精確度0.001) ，MAST ER-S/MILL α公司； TP350便攜式微量溶氧分析儀，北京時代新維測控設備有限公司；pH-10筆式pH計，上海力辰科技有限公司。

1.2 低pH急性毒性試驗

1.2.1 預試驗

采用急性毒性試驗，以HCl分析純和NaOH分析純分別配置成0.01 mol/L HCl和1 mol/L NaOH的母液與新鮮海水混合，用pH計進行pH校對配成不同pH海水。以自然海水(pH 8.0±0.1)為對照組，設5個pH梯度(3.5、4.0、5.0、6.0和7.0)，試驗不設重復，每組放10尾對蝦，在規(guī)格統(tǒng)一的100 L桶中注水20 L進行預試驗，持續(xù)處理48 h。預試驗期間不投飼，及時清理糞便，溶氧控制在6.0 mg/L。每2 h觀察并調(diào)節(jié)海水pH(保持pH變化范圍在±0.1之間)，每隔24 h記錄試驗蝦的死亡數(shù)量(個體死亡標準以魚鰓停止呼吸，心臟停止跳動為準)，并置換相應pH的新鮮海水。根據(jù)預試驗結(jié)果，確定48 h內(nèi)100%存活的最低pH和100%死亡的最高pH作為正式試驗pH范圍。所用海水為經(jīng)沉淀、過濾、消毒的自然海水，鹽度29.8，pH(8.0±0.1)，水溫(28±0.5) ℃。

1.2.2 正式試驗

由預試驗確定試驗pH范圍為3.5～5.0。以自然海水[pH(8.0±0.1)]為對照組，根據(jù)預試驗結(jié)果，按等對數(shù)間距法設定5個pH梯度(3.8、4.1、4.4、4.7和5.0)，每組2個平行，每平行放30尾對蝦，在規(guī)格統(tǒng)一的200 L桶中注水30 L進行96 h持續(xù)試驗。所用海水鹽度29.8，水溫(28±0.5) ℃，全程不投飼，及時清理糞便，溶氧控制在6.0 mg/L。每2 h觀察并調(diào)節(jié)海水pH(保持pH變化范圍在±0.1之間)，每隔24 h記錄試驗蝦的死亡數(shù)量，并完全置換相應pH的新鮮海水。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用軟件Excel 2007初步處理數(shù)據(jù)，利用SPSS軟件回歸分析得日本囊對蝦48、72和96 h的半致死摩爾濃度LC50及各pH梯度處理組的半致死時間LT50，并采用經(jīng)驗公式計算出安全摩爾濃度(SC)：SC=0.1 × LC50(96 h) 。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH脅迫下日本囊對蝦的行為觀察

試驗開始時，pH 5.0的對蝦活動基本正常，與對照組活動情況基本相同，試驗對蝦大多靜伏于實驗桶底部，少數(shù)緩慢游動；隨著脅迫時間延長，兩組試驗對蝦活動情況仍然沒有太大變化；脅迫72 h內(nèi)無死亡。pH 4.7組試驗開始時對蝦反應較強，大部分對蝦在水的上層不停游動，數(shù)小時后才伏于水底，脅迫24 h后出現(xiàn)死亡。而pH 3.8、pH 4.1、pH 4.4組，試驗開始時對蝦反應強烈，大部分對蝦在水的上層或在桶邊緣不停游動；2 h后蝦活動減少，伏于水底，用玻璃棒觸碰蝦體，蝦會迅速逃游；pH 3.8組，4 h后開始出現(xiàn)脫殼現(xiàn)象，蝦活動開始減弱，游動漸漸緩慢，出現(xiàn)蝦體變紅或變白，用玻璃棒觸碰蝦體反應遲鈍，對蝦身體彎曲，側(cè)臥水底，8 h后出現(xiàn)對蝦死亡；pH 4.1組，10 h后出現(xiàn)脫殼，16 h出現(xiàn)死亡；pH 4.4組，15 h后出現(xiàn)脫殼，19 h出現(xiàn)死亡。死亡對蝦，尾部蜷縮，附肢僵硬，經(jīng)檢查可見，對蝦頭胸甲鰓部出現(xiàn)明顯白色斑點，鰓和肝胰腺損傷嚴重，肌肉發(fā)白。

2.2 不同pH脅迫日本囊對蝦死亡情況

自然海水(pH 8.0±0.1)的對照組試驗個體均能正常生活，無死亡個體出現(xiàn)。由此基本可認為不同試驗組日本囊對蝦個體死亡均為低pH脅迫所致。在相同pH下，日本囊對蝦的死亡率隨脅迫時間的延長而增加；在相同脅迫時間內(nèi)，各組受試日本囊對蝦死亡情況隨水體pH的降低而增加。其中，pH 5.0時，受試個體72 h內(nèi)未見死亡，96 h內(nèi)死亡率僅為3.33%。pH 4.7時，受試個體在24 h后開始出現(xiàn)死亡，96 h內(nèi)死亡率為16.67%。pH 4.4、pH 4.1、pH 3.8組，受試個體在脅迫24 h內(nèi)即發(fā)生死亡，96 h內(nèi)死亡率分別為50%、90%和100%(圖1)。Pearson相關分析顯示，pH脅迫96 h內(nèi)，日本囊對蝦死亡率與水體pH呈負相關(R<0，P<0.01)。

圖1 不同pH對日本囊對蝦死亡率的影響Fig.1 Effect of different pH on mortality ofMarsupenaeus japonicus

2.3 日本囊對蝦不同時間的pH半致死摩爾濃度

利用SPSS19.0軟件進行回歸分析得，在溶氧6.0 mg/L、鹽度29.8、水溫(28±0.5) ℃的條件下，低pH對日本囊對蝦脅迫48、72、96 h的半致死摩爾濃度分別為7.907×10-5、5.140×10-5和3.673×10-5mol/L，96 h的安全摩爾濃度為3.673×10-6mol/L，對應pH分別為4.102、4.289、4.435和5.435(表1)。

2.4 日本囊對蝦不同pH的半致死時間

由表2可知，在溶氧6.0 mg/L、鹽度29.8、水溫(28±0.5) ℃的條件下，在水體pH 4.1、pH 4.4、pH 4.7時，日本囊對蝦的半致死時間分別為58.821、93.771和139.549 h。

表1 日本囊對蝦對低pH耐受性的半致死摩爾濃度Tab.1 Semi-lethal concentration of Marsupenaeus japonicus with low-pH stress

表2 各pH梯度處理組日本囊對蝦的半致死時間Tab.2 Semi-lethal time of Marsupenaeus japonicus in pH gradient treatment groups

3 討論

3.1 不同蝦對低pH脅迫的耐受性比較

pH是衡量養(yǎng)殖水體水質(zhì)的重要指標之一，pH過低會對水生生物的生長發(fā)育和生理狀況產(chǎn)生直接或間接影響，甚至導致生物死亡[24]。研究發(fā)現(xiàn)日本沼蝦幼蝦[22]、脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)[25]、凡納濱對蝦[26]幼蝦和克氏原螯蝦[9]的96 h LC50分別為4.48、4.78、4.04和3.67，而本研究中日本囊對蝦在pH脅迫96 h后的LC50為4.4356，其對低pH脅迫的耐受性要優(yōu)于日本沼蝦幼蝦和脊尾白蝦，比凡納濱對蝦幼蝦和克氏原螯蝦稍差。說明日本囊對蝦對pH沒有顯著的耐受能力；蝦的種類不同，其對低pH脅迫的耐受程度也不同。本研究可豐富有關蝦類對低pH脅迫耐受性的認識，為日本囊對蝦的健康養(yǎng)殖及耐低pH品系選育提供依據(jù)。趙先銀等[7]對中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、凡納濱對蝦和日本囊對蝦進行pH脅迫耐受性比較發(fā)現(xiàn)，日本囊對蝦對低pH脅迫的耐受性比凡納濱對蝦強。然而，本試驗結(jié)果與其測定結(jié)果不同。這可能與不同研究選用的群體、規(guī)格及測定環(huán)境條件不同有關。本試驗的日本囊對蝦采用中國臺灣海峽群體，平均體長(48.87±4.81) mm，趙先銀等[7]選用的群體平均體長較大，為(72.00±7.00) mm。日本囊對蝦具有前期底棲生活、中后期潛沙生活的習性，隨著日本囊對蝦個體的生長，是否對低pH脅迫的耐受性顯著增強，還有待進一步研究。

3.2 低 pH對日本囊對蝦的毒害作用

根據(jù)已有研究，在低摩爾濃度pH刺激后，水體pH作為脅迫因子會刺激養(yǎng)殖生物產(chǎn)生應激反應，對機體調(diào)節(jié)和免疫防御產(chǎn)生壓力[8,25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同pH脅迫下，日本囊對蝦的死亡率隨脅迫時間的延長而增加；水體pH越低，受試個體出現(xiàn)死亡的時間越早，96 h內(nèi)死亡率越高。pH 5.0時，脅迫72 h內(nèi)未見對蝦死亡，96 h內(nèi)死亡率僅為3.33%；pH 4.7時，脅迫24 h后對蝦相繼出現(xiàn)死亡，96 h內(nèi)死亡率升至16.67%；在pH 4.4、pH 4.1、pH 3.8脅迫下，對蝦24 h內(nèi)即發(fā)生死亡，96 h內(nèi)死亡率迅速增加，甚至達到100%。其原因可能是低pH脅迫會對日本囊對蝦呼吸、滲透調(diào)節(jié)和生理代謝等產(chǎn)生影響，可引起機體一系列防御應激調(diào)節(jié)。pH較高時，蝦體防御功能在脅迫前期被誘導激活，能在短時間內(nèi)發(fā)揮一定抵抗作用，抑制了pH對機體的損傷。但在脅迫后期防御系統(tǒng)受到一定抑制，個別受試個體自身調(diào)節(jié)難以抵抗低pH對機體的損傷而死亡，且pH越低，蝦體依靠自身免疫起到的抵抗作用相對越弱。過低pH脅迫時，受試個體受到強烈的pH毒性毒害，日本囊對蝦本身的固有防御體系已不能抵抗過低pH毒害，從而導致急性死亡，說明低pH對日本囊對蝦有明顯的毒害作用。由經(jīng)驗公式計算得日本囊對蝦耐受低pH脅迫的安全摩爾濃度為5.435，建議在日本囊對蝦實際養(yǎng)殖中，養(yǎng)殖水體pH如果接近或低于5.5，應引起注意并及時向養(yǎng)殖池塘灑入生石灰調(diào)節(jié)pH。

3.3 低pH脅迫對日本囊對蝦器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，低pH脅迫可引起日本囊對蝦鰓和肝胰腺組織結(jié)構(gòu)損傷。鰓是甲殼動物進行氣體交換和離子調(diào)節(jié)的重要器官[27]，如果鰓組織的結(jié)構(gòu)受損，氣體交換的能力就會減弱，易造成組織缺氧。低pH脅迫會導致鰓組織損傷，可能導致日本囊對蝦獲氧能力的下降，致使組織缺氧。肝胰腺作為日本囊對蝦重要的消化和代謝器官，具有脊椎動物肝、胰臟和腸道等的功能[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，低pH脅迫可損傷日本囊對蝦肝胰腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對肝胰腺內(nèi)的正常分泌和代謝活動造成影響，引起肝胰腺代謝功能紊亂，進而可能導致蝦體應激死亡。因此，在后期研究蝦類耐受pH脅迫的分子機制時，可選用肝胰腺或鰓作為靶標器官。

在日本囊對蝦低pH耐受試驗過程中，各試驗組海水的pH逐漸升高，這可能是日本囊對蝦分泌物呈堿性而中和酸性環(huán)境的結(jié)果，也可能是對蝦體內(nèi)的酸堿平衡調(diào)節(jié)等酶類因酸性環(huán)境而被抑制，蝦體排出大量堿性廢物所致。這提示了蝦類對pH脅迫的響應機制可從不同pH脅迫對各組織中酶活力的影響為突破口。

4 結(jié)論

初步研究了低pH對日本囊對蝦的急性毒性，用回歸分析方法分析pH對日本囊對蝦的半致死摩爾濃度和半致死時間。結(jié)果顯示：pH對日本囊對蝦脅迫48 h、72 h、96 h的半致死摩爾濃度(LC50)分別為：7.907×10-5、5.140×10-5和3.673×10-5mol/L，安全摩爾濃度(SC)為3.673×10-6mol/L，對應的pH分別為4.102、4.289、4.435、5.435；水體pH 4.1、pH 4.4、pH 4.7脅迫日本囊對蝦的半致死時間(LT50)分別為58.821、93.771 和139.549 h。結(jié)果表明，低pH對日本囊對蝦有明顯的毒害作用，會對鰓和肝胰腺的組織結(jié)構(gòu)造成損傷。本研究為今后深入研究日本囊對蝦的養(yǎng)殖、對低pH的耐受性及耐低pH品系選育提供參考。

□