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慢性腎衰竭(CRF)是所有的慢性腎臟疾病(CKD)發(fā)展的最終結局，從病理上講，包括腎小球及腎血管的硬化和腎間質纖維化。近年來，慢性腎衰竭的發(fā)病率正呈現(xiàn)逐年升高趨勢，而心血管疾病占慢性腎衰竭病人死亡原因的50%以上[1]，心血管疾病病理上的突出表現(xiàn)為左心室肥厚、冠狀動脈粥樣硬化等[2]。因此，如何積極控制并延緩腎衰竭的進展和改善心血管并發(fā)癥成為國內(nèi)外學者關注的焦點。雖然血管緊張素轉化酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑在這方面有一定的作用，但對于腎功能進行性惡化和終末期腎衰竭病人的應用受到了限制。本研究擬觀察抗纖靈對慢性腎衰竭小鼠心臟轉移生長因子-β1(TGF-β1)/Smad通路的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級8周齡C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心分籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水。

1.1.2 藥物與試劑 抗纖靈組方：桃仁12 g，丹參15 g，當歸12 g，酒大黃 9 g，懷牛膝15 g。由曙光醫(yī)院中藥房提供，煎煮20～25 min。纈沙坦膠囊(每粒80 mg)，北京諾華制藥有限公司。Trizol Reagent總RNA抽提試劑盒購自美國Invitrogen公司，實時熒光定量試劑盒及逆轉錄試劑盒購自日本TaKara公司，Masson染色試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.1.3 儀器 石蠟切片機(德國LEICA公司)、冷凍高速離心機 (德國Eppendorf公司)、顯微鏡及成像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)、ViiA 7型實時定量PCR儀(美國ABI公司生產(chǎn))。

1.2 方法 按Platt法建立慢性腎衰竭小鼠模型：小鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機將小鼠分為假手術組(8只)和手術組(27只)，以2%戊巴比妥鈉 0.07～0.08 mL進行小鼠腹腔注射，小鼠麻醉后取右側臥位充分暴露左腎區(qū)，沿左肋脊下緣 1.5 cm 處消毒做斜向切開皮膚及肌層，在腹膜后取出左腎，剝離周圍組織及腎包膜，再做弧形切口主要切除腎皮質，明膠海綿止血，縫合肌層及皮膚。7 d后再進行右腎全切除。假手術組只剝離左右腎包膜，術后2周眼眶采血測血肌酐，觀察模型是否成功。

造模成功后，隨機將手術組小鼠分為模型組(9只)、纈沙坦組(9只)、抗纖靈組(9只)?？估w靈組予抗纖靈方煎劑0.5 mL 灌胃，藥物濃度為20 g/kg ，每日1次；纈沙坦組予纈沙坦0.5mL灌胃，藥物濃度為20mg/kg，每日 1次；模型組和假手術組均予等量蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃22周。實驗終點時，模型組及抗纖靈組各剩6只，纈沙坦組、假手術組剩7只。

1.3 取材 各組小鼠眼球摘除取血后，迅速剪開胸廓，取心臟，生理鹽水洗凈，吸干多余水分，剪取一部分左心室放入4%多聚甲醛中行Masson染色并計算膠原面積；剩余部分心臟放入冷存管，存放于-80 ℃冰箱備用。

1.4 心臟膠原面積的比較 Masson染色示小鼠的心肌纖維呈紫紅色，膠原纖維呈藍色。每張切片隨機選取4個高倍視野，用Image Pro6圖像分析軟件進行分析，比較每組心臟膠原面積占整個視野的百分比。

1.5 小鼠心臟組織TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA的表達 從-80 ℃冰箱中取出小鼠心臟組織，根據(jù)Trizol說明書進行RNA的抽提，用紫外分析測定所需提取2 μg的RNA體積，加DEPC水補足體積至8 μL。在 PCR管中依次加入： 5×RT buffer 0.8 μL，Inhibitor 0.4 μL，10 mmol/L dNTP mix 0.4 μL，Transcriptase 0.4 μL，使最終體積為 10 μL。在 PCR體系中依次加入(冰上操作)： 梯度稀釋標準品或RT產(chǎn)物1 μL， SYBR premix ex taq 10 μL，RT Primer Mix 1 μL，RNase Free dH2O 7.6 μL，RoxII 0.4 μL，總體積20 μL。用熒光定量專用的PCR封口膜覆蓋 96孔 PCR板，瞬時離心后放入熒光定量 PCR儀內(nèi)，設定反應條件： 95 ℃ 15 s預變性，95 ℃5 s變性，60 ℃30 s退火，40 個循環(huán)。根據(jù)溶解曲線判斷 PCR反應的特異性。引物信息：TGF-β1上游CCACCTGCAAGACCATCGAC，下游CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC，產(chǎn)物長度91；Smad3 上游ACTAACTTCCCTGCTGGCAT，下游ACTGGCTGTAGGTCCAAGT，產(chǎn)物長度183；SMAD7上游CTCTGTGAACTAGAGTCTCCCC下游GCTCCAGAAGAAGTTGGGAATC，產(chǎn)物長度163。以GAPDH為內(nèi)參。

2 結 果

2.1 對小鼠心臟膠原面積的影響 與假手術組比較，模型組的小鼠心臟膠原面積顯著增大(P<0.01)，抗纖靈組和纈沙坦組與模型組比較，心臟膠原面積顯著縮小(P<0.01)，且抗纖靈組與纈沙坦組組間比較無統(tǒng)計學意義。詳見表1。

表1 各組小鼠心臟膠原面積的比較(±s)

與假手術組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01

2.2 對小鼠心臟組織TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表達水平的影響 模型組TGF-β1、Smad3 mRNA與假手術組比較顯著升高(P<0.01)，模型組Smad7 mRNA與假手術組比較顯著降低(P<0.01)。治療后與模型組比較，抗纖靈組及纈沙坦組能顯著降低TGF-β1mRNA的表達(P<0.01)，降低Smad3 mRNA的表達(P<0.05)，抗纖靈組與纈沙坦組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經(jīng)治療，抗纖靈組及纈沙坦組Smad7 mRNA與模型組比較有顯著上升(P<0.01)，兩組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠心臟組織TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA相對表達水平比較(±s)

與假手術組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

3 討 論

慢性腎衰竭病人心血管疾病的發(fā)生率是患腎臟疾病腎正常者的5～10倍，主要表現(xiàn)為心室肥大、心肌缺血、心力衰竭和心源性猝死。美國高血壓聯(lián)合報告中已明確將腎臟疾病列為心血管疾病的獨立高危因素[3]。慢性腎衰竭引起的心血管疾病與貧血、電解質紊亂、微炎癥狀態(tài)、氧化應激、局部腎素-血管緊張素激活、TGF-β1/Smad通路等多種因素有關。西醫(yī)的治療主要為擴血管、對癥處理、透析和移植等。

慢性腎衰竭在中醫(yī)學上并無此病名，根據(jù)其主要表現(xiàn)可歸屬于“溺毒”“關格”“水腫”等范疇；而慢性腎衰竭引起的心臟病變又隸屬于“心悸”“胸痹”等范疇。何立群教授認為本病的中醫(yī)病機為腎氣虧虛、瘀血阻絡，瘀濁內(nèi)停而循經(jīng)上犯，心脈瘀阻致心失所養(yǎng)，日久發(fā)而為病。確立了活血化瘀、補腎瀉濁的治療方法，方選抗纖靈扶正泄?jié)?，攻補兼施。抗纖靈方中丹參性微寒，歸心、肝經(jīng)，補血活血；牛膝性平，歸肝、腎經(jīng)，補腎活血；桃仁性平，歸心肝、大腸經(jīng)，祛瘀活血；酒大黃性寒，歸脾胃、大腸、心、肝經(jīng)，清熱瀉濁活血，當歸性溫，歸心、肝、脾經(jīng)，補血活血。動物實驗發(fā)現(xiàn)抗纖靈能抑制慢性腎衰竭大鼠腎組織TGF-β1/Smad通路的過度表達，抑制細胞外基質增生和積聚，促進細胞外基質的降解，具有改善腎纖維化和保護腎功能的作用[4]。那么抗纖靈組方能否通過改善腎功能而減輕或預防腎功能不全引起的諸如心肌纖維化等心臟病變，有待更深入的研究。

作為國際公認的促纖維化生長因子TGF-β1，可促進心肌細胞和腎小球細胞外基質的合成與沉積，并通過Smad通路等加重心、腎纖維化的過程[5]。Smad 家族被認為參與了多種原發(fā)性和繼發(fā)性心臟疾病的生理病理過程，它是 TGF-β1信號傳導通路里重要的效應因子，可被TGF-β1通過細胞膜表面受體啟動，然后將信號傳導到細胞核內(nèi)，能調節(jié)靶基因的轉錄從而誘導其下游因子的表達。研究表明作為TGF-β1下游因子的Smad3被激活后能通過促進心肌纖維化引起心室重構[6]。在心室長期處于壓力超負荷的情況下，Smad3作用增強，而Smad7作用減弱，這些都促進了TGF-β1致心肌纖維化和心室重構的發(fā)展[7]。Smad7可抑制心肌成纖維細胞膠原蛋白的合成，作為抑制型Smad，它與TGF-β受體復合物中的TGFβRI競爭性結合，阻斷Smad2、Smad3的信號傳導過程，抑制心室重構。除此之外，Smad7 還能與相對應的效應元件結合，通過分解 TGF-β1誘導的 Smad-DNA 復合物等方式起到抑制信號通路的作用[8]。

本實驗結果顯示，模型組的小鼠心臟膠原面積較假手術組顯著增大，提示心肌間質出現(xiàn)了明顯的纖維化，由此可見，慢性腎衰竭引起心臟病變的造模是成功的。抗纖靈治療后小鼠心臟膠原面積得到了明顯改善，表明抗纖靈能改善心肌纖維化，從而影響慢性腎衰竭引起的心臟重構。纈沙坦是特異性AT1受體拮抗劑，能阻斷血管緊張素Ⅱ而具有抗細胞增殖和纖維化的效應。在抗心肌纖維化方面，抗纖靈組與纈沙坦組比較，兩者無統(tǒng)計學意義，提示抗纖靈與纈沙坦療效相當。治療后抗纖靈組的TGF-β1、Smad3 mRNA較模型組下調，Smad7 mRNA顯著上調，與纈沙坦比較無統(tǒng)計學意義，表明該方能通過調節(jié)TGF-β1/Smad通路發(fā)揮抗心肌纖維化的效果。

綜上所述，抗纖靈具有對抗慢性腎衰竭引起的心肌纖維化作用，其作用機制可能與下調TGF-β1和Smad3 mRNA的表達、上調Smad7 mRNA的表達有關。