王 東，趙 雪，宋京九，祝 鈞

（北京工商大學(xué) 理學(xué)院，北京 100048）

咖啡酸（CA）又名水解咖啡鞣酸、3，4-二羥基肉桂酸[1]。咖啡酸作為天然存在的酚酸類化合物，是次生植物代謝產(chǎn)物，并且?guī)缀踉谒兄参镏卸即?在[2，3]?？Х人嵊质翘烊坏目寡趸瘎?，不但可以影響食物的色澤、穩(wěn)定性、風(fēng)味、營養(yǎng)價(jià)值，而且在化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用[4-6]。氧化是電子從一個(gè)原子向另一個(gè)原子的轉(zhuǎn)移，是有氧生命新陳代謝的重要組成部分，當(dāng)機(jī)體內(nèi)電子發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生自由基[7]。常見的有氧自由基、羥基自由基等，活性氧自由基有高度反應(yīng)性，攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、酶，誘導(dǎo)引發(fā)細(xì)胞、組織的損傷，使得生物機(jī)體遭到破壞[8]。Son等[9]研究了咖啡酸的抗氧化性，認(rèn)為使得咖啡酸具有良好的抗氧化性的原因是其分子結(jié)構(gòu)中鄰苯二酚環(huán)中的鄰二羥基官能團(tuán)?？Х人嵋兹苡谝掖己蜔崴?，微溶于冷水[10]，在常見溶劑體系中的溶解度很低、配伍性差，且來源天然的咖啡酸衍生物有效性差等原因，限制了其應(yīng)用[11，12]。Yoo等[13]在1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、1-羥基苯并三唑（HOBt）的作用下，合成一系列咖啡酰胺化合物，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子有很好的清除作用，對(duì)脂質(zhì)過氧化有很好的抑制作用。Aladedunye等[14]合成了12種高收率的二氫咖啡酰胺化合物，采用清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。發(fā)現(xiàn)這些新化合物比α-生育酚和丁基化羥基甲苯（BHT）具有顯著清除自由基的作用。因此，通過合成咖啡酸酰胺類化合物，既可以保持其生物活性，又可以擴(kuò)大其應(yīng)用 范圍。

筆者以咖啡酸和氨基酸乙酯鹽酸鹽為原料通過HOBt/EDC法合成4種咖啡酸氨基酸類衍生物，運(yùn)用核磁共振氫譜（1H NMR）和高效液相色譜-質(zhì)譜 （HPLC-MS）表征確定4種化合物的結(jié)構(gòu)。通過體外清除DPPH自由基、羥基自由基試驗(yàn)、紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)來表征目標(biāo)產(chǎn)物的抗氧化活性及刺激性，以期為咖啡酰氨基酸衍生物作為新化妝品原料的應(yīng)用提供理論 指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1. 1 主要試劑與儀器

咖啡酸、甘氨酸乙酯鹽酸鹽、丙氨酸乙酯鹽酸鹽、L-絲氨酸乙酯鹽酸鹽、L-蘇氨酸乙酯鹽酸鹽、HOBt、EDC，北京伊諾凱科技有限公司。醋酸、七水合硫酸亞鐵、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺（DMF）、三乙胺、鄰二氮菲、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、菲洛嗪、抗壞血酸（Vc），均為分析純，北京化玻站生物分析技術(shù)有限公司；新鮮兔血，北京海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠；十二烷基硫酸鈉（SDS），美國Amresco Biotechnology Grade。

OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；XK-88微型加熱磁力攪拌器，揚(yáng)州市邗江公道玻璃儀器廠；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；TE212-L電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；核磁共振儀，瑞士Bruker；Xevo G2 Q-TOF質(zhì)譜儀，美國Waters；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀，瑞士Tecan；臺(tái)式離心機(jī)，德國Eppendorf Centrifuge 5810 R。

1. 2 咖啡酰氨基酸酯衍生物的合成[11]

本研究主要采用甘氨酸乙酯鹽酸鹽、丙氨酸乙酯鹽酸鹽、L-絲氨酸乙酯鹽酸鹽和L-蘇氨酸乙酯鹽酸鹽在EDC脫水劑的作用下分別與咖啡酸進(jìn)行反應(yīng)，生成相應(yīng)的咖啡酰氨基酸乙酯，具體結(jié)構(gòu)式見下。

實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物均以咖啡酸（8.25 mmol）與相應(yīng)的氨基酸鹽酸鹽（8.25 mmol）為原料合成。以咖啡酰甘氨酸乙酯的合成為例。向置于冰水浴中的圓底燒瓶中加入已溶解在DMF（25 mL）中的咖啡酸（1.5 g，8.25 mmol）、l-羥基苯并三唑（1.15 g，8.5 mmol）和甘氨酸乙酯鹽酸鹽（1.15 g，8.25 mmol），慢慢滴加三乙胺（3.45 mL，24.75 mmol），反應(yīng)10 min后，加入EDC （1.6 g，8.35 mmol），自然升溫到25 ℃，反應(yīng)18 h。用薄層層析法（TLC）檢測(cè)是否反應(yīng)完全。若沒有完全，繼續(xù)反應(yīng)，直至反應(yīng)完全。將反應(yīng)物倒入200 mL水中，分別用乙酸乙酯（4×100 mL）萃取和飽和食鹽水（2×100 mL）沖洗，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥過夜、過濾、硅膠柱色譜柱分離（洗脫劑為乙酸乙酯和石油醚，體積比為1∶2），減壓蒸去溶劑，得到稠狀膏體，真空干燥得到淺黃色固體。

1. 3 咖啡酰氨基酸酯衍生物的結(jié)構(gòu)鑒定

1. 3. 1 咖啡酰氨基酸酯衍生物TLC鑒定

對(duì)經(jīng)過色譜柱純化后的各化合物溶液進(jìn)行薄層色譜分析。薄層層析硅膠板GF254（50 mm×200 mm），展開劑為乙酸乙酯和石油醚（體積比為1∶2）。對(duì)照物質(zhì)為咖啡酸（7.5 g/L），檢測(cè)是否為單一斑點(diǎn)。

1. 3. 2 咖啡酰氨基酸酯衍生物1H NMR表征

各稱取5 mg咖啡酰氨基酸乙酯衍生物，分別溶解于0.5 mL的氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）或氘代丙酮（C3D6O）中，配制成10 g/L的樣品溶液置于核磁共振管中。儀器運(yùn)行條件：AV400 MHz。通過氫譜的數(shù)據(jù)分析目標(biāo)產(chǎn)物中氫的類型及數(shù)量。

1. 3. 3 咖啡酰氨基酸酯衍生物HPLC-MS表征

樣品的配制：取1 mg咖啡酰氨基酸酯衍生物溶解在1 mL的質(zhì)譜級(jí)乙腈中，配制成1 g/L的溶液，稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg/L的待測(cè)液。液相色譜條件：流動(dòng)相為乙腈和水。質(zhì)譜條件：ESI離子源，ESI+；掃描范圍 m/z 50～500；電噴霧電壓4 500 V。

1. 4 清除DPPH自由基試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[15]中的方法測(cè)定了樣品清除DPPH自由基能力：各待測(cè)組分均用無水乙醇溶解，配制成一系列濃度，將不同濃度的樣品溶液（1 mL）與1 mL DPPH （2×10-4mol/L）的乙醇溶液混合，對(duì)混合物進(jìn)行劇烈搖動(dòng)，在黑暗中停留30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度，以Vc作為陽性對(duì)照。樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力以IC50（DPPH自由基抑制率達(dá)50%所需的物質(zhì)濃度）表示。DPPH自由基抑制率按下式計(jì)算。

DPPH自由基抑制率=[（Ab+Ac-Aa）/Ab]×100%

式中，Aa為樣品組（1 mL待測(cè)液與1 mL DPPH溶液混合）吸光度，Ab為對(duì)照組（1 mL待測(cè)物溶劑與1 mL DPPH溶液混合）吸光度，Ac為空白組（1 mL待測(cè)液與1 mL無水乙醇混合）吸光度。

1. 5 清除羥基自由基試驗(yàn)

用文獻(xiàn)[16]的方法測(cè)定樣品對(duì)羥基自由基的清除能力，用DMSO溶液將待測(cè)物配制成不同濃度的溶液。取磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH=7.4）、菲啰啉的乙醇溶液（0.75 mmol/L）、FeSO4水溶液（0.75 mmol/L）、樣品溶液各1 mL加入試管中，再加入1 mL H2O2水溶液（H2O2體積分?jǐn)?shù)0.01%），混勻。反應(yīng)混合物在37 ℃下孵育1 h，在536 nm處測(cè)定混合物的吸光度值，以Vc作為陽性對(duì)照。用IC50（抑制率達(dá)50%所需的樣品濃度）表示樣品的清除羥基自由基的能力。羥基自由基抑制率計(jì)算公式如下。

羥基自由基抑制率=[（Ac-Ab）/（Aa-Ab）]×100%

式中，Aa為對(duì)照組（用1 mL水代替1 mL H2O2）吸光度，Ab為空白組（用1 mL水代替1 mL待測(cè)液）吸光度，Ac為樣品組吸光度。

1. 6 紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)

紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）溶血試驗(yàn)是根據(jù)原料對(duì)血紅細(xì)胞細(xì)胞膜的刺激，導(dǎo)致其破裂后血紅蛋白漏出，分光光度法測(cè)定化學(xué)物質(zhì)作用后的紅細(xì)胞懸液的吸光度，可以計(jì)算出溶血率。在相同RBC濃度和樣品濃度下，吸光度越大，說明細(xì)胞溶血率越高，表明樣品的刺激性越強(qiáng)。預(yù)先配制pH=7.4的磷酸鹽緩沖液（添加葡萄糖1.8 g/L）及抗凝劑檸檬酸緩沖液（20 g/L檸檬酸三鈉C6H5Na3O7·2H2O，8 g/L檸檬酸C6H8O7）。樣品均用磷酸鹽緩沖液稀釋配制濃度均為1 mmol/L（咖啡酸衍生物均溶解于DMSO）。以SDS （1.3 g/L）作為陽性對(duì)照。新鮮血液（已用檸檬酸抗凝劑處理）用磷酸鹽緩沖液稀釋后，經(jīng)離心除雜，配制體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞懸液，搖晃均勻。各樣品溶液與RBC懸液按V（樣品）∶V（RBC）= 3∶1添加于離心管中，混勻，用去離子水和PBS分別替代樣品按相同體積比添加，作為完全溶血和陰性對(duì)照，然后于室溫下?lián)u床孵育1 h。取出受試物/RBC混合液置于離心機(jī)中，反應(yīng)物于10 000 r/min速度下離心1 min，終止孵育。于540 nm處測(cè)定其吸光度值（每個(gè)濃度測(cè)定3個(gè)平行，結(jié)果取平均值）。溶血率計(jì)算公式如下。

紅細(xì)胞溶血率=[（A樣品-A陰性）/（A完全溶血-A陰性）]×100%

式中，A陰性為PBS緩沖溶液作用于紅細(xì)胞懸液后測(cè)定的吸光度值，A完全溶血為去離子水作用于紅細(xì)胞懸液后測(cè)定的吸光度值，A樣品為樣品作用于紅細(xì)胞懸液后測(cè)定的吸光度值。

1. 7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)源于3次重復(fù)試驗(yàn)。采用線性擬合計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與討論

2. 1 咖啡酸酰氨基酸乙酯的結(jié)構(gòu)表征

化合物a，b，c和d的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR 和HPLC-MS表征，確定其結(jié)構(gòu)及分子量，與預(yù)期目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)果一致，表征結(jié)果如下：

a：產(chǎn)率：60%；黃色固體；熔點(diǎn)：167～170 ℃；1H NMR （400 MHz，DMSO-d6）：9.39 （s，1H，OH），9.15 （s，1H，OH），8.40 （s，1H，NH），7.26 （d，J=15.6 Hz，1H，HC=C），6.97 （s，1H，ArH），6.86 （d，J=8.2 Hz，1H，ArH），6.75（d，J=8.1 Hz，1H，ArH），6.40（d，J=15.7 Hz，1H，C=CH），4.10（q，J=7.1 Hz，2H，CH2），3.90（d，J=5.9 Hz，2H，OCH2），1.20（t，J= 7.1 Hz，3H，CH3）；ESI+-MS （m/z）：266.063 5（ [M+H]+）。

b：產(chǎn)率：73%；黃色固體；熔點(diǎn)：122～126 ℃；1H NMR （400 MHz，DMSO-d6）：9.39 （s，1H，OH），9.16 （s，1H，OH），8.38 （d，J=6.7 Hz，1H，NH），7.25 （d，J=15.6 Hz，1H，HC=C），6.95 （s，1H，ArH），6.84 （d，J=7.9 Hz，1H，ArH），6.75 （d，J=8.0 Hz，1H，ArH），6.38 （d，J=15.7 Hz，1H，C=CH），4.40～4.24 （m，1H，CH），4.09 （dd，J=14.0，7.0 Hz，2H，OCH2），1.31（d，J=7.3 Hz，3H，CH3），1.19 （t，J=7.1 Hz，3H，CH3）；ESI+-MS （m/z）：280.046 8 （[M+H]+）。

c：產(chǎn)率：66%；淺黃色固體；熔點(diǎn)：124～126 ℃；1H NMR （400 MHz，C3D6O）：8.19 （s，1H，OH），7.98（s，1H，OH），7.42 （s，1H，NH），7.13 （d，2H，HC=C），6.98 （d，J=15.6 Hz，1H，ArH），6.66 （d，J=15.6 Hz，1H，ArH），6.81 （d，J=37.4 Hz，1H，ArH），4.66 （s，1H，OH），4.17 （t，J=10.4 Hz，1H，CH），3.97 （d，J=10.8 Hz，2H，OCH2），2.97 （dd，J=136.7，101.0 Hz，2H，OCH2），1.47～1.07（m，3H，CH3）；ESI+-MS（m/z）：296.037 （[M+H]+）。

d：產(chǎn)率：76%；黃色固體；熔點(diǎn)：79～81 ℃；1H NMR （400 MHz，C3D6O）：8.17（s，1H，OH），8.04（s，1H，OH），7.31（s，1H，NH），7.02（d，J=40.9 Hz，2H，HC=C），6.86（d，J=8.1 Hz，1H，ArH），6.61（d，J=15.6 Hz，1H，ArH），6.72（d，J=8.1Hz，1H，ArH），4.45（d，J=6.1 Hz，1H，OH），4.22（s，1H，CH），4.02（q，J=7.1 Hz，2H，OCH2），3.92（d，J=7.1 Hz，1H，CH），2.90～2.56（m，3H，CH3），1.27～0.69（m，3H，CH3）；ESI+-MS（m/z）：309.31（[M+H]+）。

2. 2 DPPH自由基清除能力的比較

IC50值越小，表明其對(duì)DPPH自由基清除能力越強(qiáng)，反之，則越弱?？Х弱０被狨パ苌锴宄鼶PPH自由基的IC50值見表1，各數(shù)值間差異顯著（P＜0.05）?？Х弱０被狨パ苌锴宄鼶PPH自由基能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋篶＞d＞a＞CA＞b＞VC?？芍Х弱０被狨パ苌锴宄鼶PPH自由基的能力明顯高于常用抗氧化劑Vc（陽性對(duì)照）。而且咖啡酸與不同氨基酸成酰胺后清除自由基活性強(qiáng)弱明顯不同，表明側(cè)鏈氨基酸基團(tuán)對(duì)于咖啡酰胺類衍生物的抗氧化性影響顯著，氨基酸基團(tuán)對(duì)清除活性影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋航z氨酸＞蘇氨酸＞甘氨酸＞丙氨酸。4種合成的咖啡酸衍生物中咖啡酰絲氨酸乙酯清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，其IC50值為13.5 μmol/L。

表 1 不同合成產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除效應(yīng)Tab. 1 Sc avenging effects of different synthetic products on DPPH free radicals

2. 3 羥基自由基清除能力的比較

不同咖啡酰氨基酸酯衍生物作用于羥基自由基后IC50值如表2所示，各數(shù)值間具有顯著性差異（P＜0.05）。它們對(duì)羥基自由基的清除能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋篵＞c＞d＞CA＞a＞VC?？芍Х人峒捌漉０奉愌苌飳?duì)于羥基自由基的清除能力均強(qiáng)于常用抗氧化劑VC（陽性對(duì)照）。不同咖啡酰氨基酸酯衍生物清除羥基自由基能力的不同，反應(yīng)出其抗氧化的強(qiáng)弱與化合物的側(cè)鏈氨基酸基團(tuán)有關(guān)。4種合成的咖啡酸衍生物中咖啡酰丙氨酸乙酯清除羥基自由基能力最強(qiáng)，其IC50值為0.214 mmol/L。

表 2 不同合成產(chǎn)物對(duì)羥基自由基的清除效應(yīng)Tab. 2 Scavenging effects of different synthetic products on OH radicals

2. 4 紅細(xì)胞溶血率

前期研究發(fā)現(xiàn)配制樣品濃度越大，對(duì)應(yīng)的RBC溶血率越高，說明樣品濃度越大，對(duì)紅細(xì)胞膜的刺激性越強(qiáng)。樣品溶血率值如表3所示，反應(yīng)樣品濃度為1 mmol/L（SDS質(zhì)量濃度為1.3 g/L）時(shí)對(duì)紅細(xì)胞膜的刺激性大小，樣品溶血率由大到小排序?yàn)椋篠DS（74%）＞ CA（2.39%）＞a（2.38%）＞b（1.07%）＞DMSO（0.89%）、d（-0.38%）、c（-0.85%）。由溶血率大小推知，咖啡酸與氨基酸乙酯鹽酸鹽成酰胺后刺激性明顯降低。

表 3 不同合成產(chǎn)物溶血率Tab. 3 Effects of different compounds on hemolysis ratio

3 結(jié)論

合成了咖啡酰甘氨酸乙酯、咖啡酰丙氨酸乙酯、咖啡酰絲氨酸乙酯、咖啡酰蘇氨酸乙酯，且后三種咖啡酰氨基酸乙酯未見文獻(xiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4種咖啡酸酰胺類衍生物溶解性無明顯增加，但功效性均有提高，都呈現(xiàn)了較好的抑制DPPH自由基、羥基自由基活性的效果，且咖啡酰絲氨酸乙酯清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，其IC50值為13.5 μmol/L；咖啡酰丙氨酸乙酯清除羥基自由基能力最強(qiáng)，其IC50值為0.214 mmol/L。不同咖啡酰氨基酸酯衍生物對(duì)DPPH、羥基自由基抑制作用活性排序差異性可能是由于不同功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)體系反應(yīng)機(jī)理不同導(dǎo)致的偏差，4種合成產(chǎn)物抗氧化性存在差異，這主要是由于氨基酸的結(jié)構(gòu)不同而導(dǎo)致的差異性。4種咖啡酸酰胺類衍生物相對(duì)于咖啡酸單體對(duì)紅細(xì)胞膜的刺激性更弱，表明改性后的咖啡酸具有更高的安全性。