嚴(yán)忠雍，張小軍，陳 思，李佩佩，龍 舉，張 虹

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；2.浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018)

短裸甲藻毒素(Brevetoxin，BTX)是一類聚醚類的脂溶性藻毒素，主要是由雙鞭甲藻及裸甲藻屬部分藻類產(chǎn)生的赤潮藻毒素[1-3]。短裸甲藻毒素是由10～11個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)組成的大環(huán)多醚類物質(zhì)，為較強(qiáng)的鈉通道激活毒素，可與鈉通道受體靶部位Ⅵ結(jié)合，開啟細(xì)胞膜上的鈉通道，使細(xì)胞膜對鈉離子的通透性增強(qiáng)，活化電壓門控鈉通道，進(jìn)而產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞去極化作用，引起神經(jīng)肌肉興奮的傳導(dǎo)發(fā)生改變，因此亦被稱為神經(jīng)性貝類毒素[4]。短裸甲藻毒素具有熱穩(wěn)定性，其在貝類等生物體中的消除半衰期長達(dá)數(shù)十天甚至數(shù)月，加熱、微波等常規(guī)加工方式因降低了水產(chǎn)品的含水量而導(dǎo)致毒素濃度升高，會使食用者產(chǎn)生惡心、嘔吐、腹瀉、麻痹、昏迷等中毒癥狀[5-6]。因此，有必要加強(qiáng)水產(chǎn)品中短裸甲藻毒素的檢測工作，以利于海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測和水產(chǎn)品質(zhì)量安全保障。

目前，短裸甲藻毒素的分析方法主要有小鼠生物法[7]、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[8]、放射免疫法[9]、酶聯(lián)免疫法[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-15]。其中，小鼠生物法發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛，但無法精確定量；酶聯(lián)免疫法檢測時(shí)間短，但易出現(xiàn)交叉反應(yīng)；而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因分離能力強(qiáng)、靈敏度高而成為短裸甲藻毒素的首選分析方法。貝類除了含有脂肪、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)外，通常還含有分泌黏液，導(dǎo)致液液萃取過程中常出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，同時(shí)也使一部分目標(biāo)物被吸附，造成回收率低。因此，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定貝類中短裸甲藻毒素主要以固相萃取法為前處理凈化手段，包括硅膠SPE柱[13]、聚合物SPE柱[15]等。硅膠SPE柱雖能有效凈化貝類樣品，但僅測定了BTX-C；聚合物SPE柱能同時(shí)測定3種短裸甲藻毒素，但前處理耗時(shí)長。本實(shí)驗(yàn)以BTX類的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)BTX-A和BTX-B，以及BTX類中毒性最強(qiáng)的BTX-C為研究對象，C18固相萃取柱為凈化手段，優(yōu)化了樣品提取及萃取條件，縮短了前處理時(shí)間，并結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏性和精確性，應(yīng)用于貝類中BTX-A、BTX-B、BTX-C 3種短裸甲藻毒素的同時(shí)測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTMI-Class超高效液相色譜Xevo TQ-S質(zhì)譜儀(美國Waters公司);SPE-24固相萃取裝置(美國Supelco公司 )；MS3 Digital旋渦混合器(德國IKA公司)；Centrifuge5810高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation公司)；Sep-Pak Vac C18固相萃取柱(6 mL/1 000 mg，美國Waters公司)。

BTX-A、BTX-B、BTX-C標(biāo)準(zhǔn)品(均為100 μg，臺灣Algalchem公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，美國Sigma公司)；乙腈、甲醇、丙酮(色譜純，德國Merck公司)；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Millipore系統(tǒng)處理的超純水。

BTX混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10 mg/L)：用甲醇溶解BTX-A、BTX-B、BTX-C標(biāo)準(zhǔn)品，混合后定容至10 mL，于-20 ℃保存，有效期6個(gè)月。

BTX混合標(biāo)準(zhǔn)使用液(1 mg/L)：取1 mL BTX混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋配成1 mg/L的混合溶液，于-20 ℃保存，有效期1個(gè)月。

1.2 樣品前處理方法

稱取1.00 g(準(zhǔn)確至0.01 g)均質(zhì)的待測樣品，置于15 mL離心管中，加入4 mL丙酮，渦旋振蕩2 min，常溫下超聲振蕩10 min，以5 000 r/min離心6 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管后加入16 mL水，超聲振蕩0.5 min，待凈化。

移取上述混合液加至已用10 mL 20%(體積分?jǐn)?shù))丙酮水溶液活化的C18固相萃取柱。上樣結(jié)束后，用5 mL 20%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液淋洗，抽干柱內(nèi)殘留液，并棄去全部流出液，再用3 mL乙腈洗脫，洗脫液收集于15 mL離心管中，旋渦振蕩1 min，過0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜后，待分析。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITYTMUPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；進(jìn)樣體積為10 μL；樣品室溫度為4 ℃；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min；流動相：A為含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈。梯度洗脫：0～0.5 min，50% A；0.5～1.5 min，50%～35%A；1.5～9.0 min，35% A；9.0～10 min，35%～50%A；10～11 min，50%A。

表1 短裸甲藻毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of BTX

*quantitative ion

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描(ESI+)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；錐孔氣流量：150 L/h；脫溶劑氣流量：600 L/h；短裸甲藻毒素的母離子及子離子等質(zhì)譜條件如表1所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

BTX-A、BTX-B、BTX-C屬親脂性化合物，其結(jié)構(gòu)相似，常規(guī)的C18色譜柱即能滿足BTX液相色譜分析的需要。對3種BTX標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分離時(shí)發(fā)現(xiàn)，以含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液為水相，乙腈為有機(jī)相時(shí)，采用50 mm長的C18色譜柱在5 min內(nèi)可有效分離3種分析物，且峰形尖銳對稱；但采用相同條件對樣品進(jìn)行分析時(shí)，目標(biāo)峰無法有效積分，信噪比低。因此改用長色譜柱，延長分析時(shí)間，并調(diào)試流動相的最佳梯度，最終確定最佳色譜分離條件如“1.3”所示。在此條件下，目標(biāo)峰可在11 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離，且峰形尖銳，基線平穩(wěn)(圖1)。

圖1 液相色譜優(yōu)化條件下的貽貝樣品MRM圖

2.2 進(jìn)樣試劑的優(yōu)化

在液相色譜分析領(lǐng)域，通常采用初始流動相溶解分析物以去除溶劑效應(yīng)，但3種BTX均為脂溶性毒素，分析時(shí)需溶于乙腈中，因此不能采用初始流動相。對比了3種BTX在不同體積分?jǐn)?shù)乙腈中的響應(yīng)值，結(jié)果顯示，在0～50%范圍內(nèi)隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增大，3種BTX的響應(yīng)值顯著增強(qiáng)；乙腈超過50%后響應(yīng)值增加緩慢，乙腈比例為100%時(shí)達(dá)到最大值。因此，選擇純乙腈為定容試劑，未將固相萃取洗脫液(3 mL乙腈)濃縮，而選擇直接上機(jī)分析；不僅提高了目標(biāo)物響應(yīng)值，同時(shí)省去了濃縮步驟，縮短了前處理時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。

2.3 質(zhì)譜條件的確定

比較了正、負(fù)離子模式下3種BTX的響應(yīng)信號，并對錐孔溫度、脫溶劑氣流量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：3種BTX在ESI+模式下的響應(yīng)值較ESI-模式高，可產(chǎn)生穩(wěn)定的 [M+H]+特征離子，將其確定為分析物的準(zhǔn)分子離子峰，并優(yōu)化毛細(xì)管電壓和錐孔電壓。通過對準(zhǔn)分子離子峰的二級質(zhì)譜裂解進(jìn)行分析，根據(jù)碎片離子的豐度強(qiáng)弱，對定量定性離子和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，最終確定的定量定性離子和碰撞能量見表1，3種BTX的二級離子質(zhì)譜圖見圖2。

2.4 提取條件的優(yōu)化

分別比較了丙酮、甲醇、乙腈3種提取劑對BTX的提取效率。結(jié)果表明，甲醇雖能沉淀蛋白質(zhì)，但對3種BTX的提取效率較低；乙腈為極性非質(zhì)子溶劑，對3種BTX的提取率較高，但乙腈毒性較大；而丙酮對3種BTX的提取率最高，因此對丙酮用量進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，最終選擇4 mL丙酮作為提取劑。

2.5 固相萃取條件的優(yōu)化

BTX結(jié)構(gòu)中大量存在的碳?xì)滏I能與C18官能團(tuán)上的碳?xì)滏I產(chǎn)生非極性作用力，適合采用C18固相萃取柱富集凈化。提取劑丙酮的非極性作用力較大，易與固相萃取柱的官能團(tuán)相結(jié)合，導(dǎo)致丙酮中的BTX不能有效富集，因此將4 mL丙酮與16 mL水混合作為上樣液，以增強(qiáng)上樣液的極性，提高目標(biāo)物的富集效率。實(shí)驗(yàn)選擇20%甲醇水作為淋洗液，能有效去除柱內(nèi)的殘留雜質(zhì)，且不影響目標(biāo)物的化學(xué)狀態(tài)。根據(jù)洗脫液和目標(biāo)物的極性，分別考察了采用乙腈、甲醇作為洗脫液時(shí)目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果表明：甲醇雖能有效洗脫BTX，但色譜基線干擾較大，信噪比低；而用3 mL乙腈即能有效洗脫目標(biāo)物，且色譜基線較穩(wěn)，信噪比和靈敏度較高，因此選擇3 mL乙腈為洗脫液。

圖2 3種BTX的二級離子質(zhì)譜圖

2.6 方法的基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系及定量下限

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)是指基質(zhì)中除分析物以外的其他成分對分析物測定值的影響。實(shí)驗(yàn)通過在處理過的空白基質(zhì)中添加BTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白基質(zhì)中BTX的響應(yīng)值與純?nèi)軇┲蠦TX的響應(yīng)值之比為ME值，計(jì)算得到本方法的ME值為94.6%～103.5%，表明不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)影響。

移取適量3種BTX混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,配制質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以BTX的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。3種BTX均在1.0～100 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996～0.997。以3倍信噪比確定本方法的檢出限(LOD)為1.0 μg/kg，以10倍信噪比確定本方法的定量下限(LOQ)為3.0 μg/kg。

2.7 方法回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

準(zhǔn)確稱取1.00 g陰性貽貝、縊蟶和青蛤樣品，添加5.0、20、50 μg/kg 3個(gè)濃度水平的3種BTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平重復(fù)6次，計(jì)算方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明，在3個(gè)加標(biāo)水平下3種BTX的平均回收率為80.0%～87.5%；RSD為1.3%～5.4%(見表2)。

表2 3種短裸甲藻毒素的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Average recoveries and RSDs for 3 BTX(n=6)

2.8 實(shí)際樣品分析

為確證方法的有效性和實(shí)用性，采用本方法對養(yǎng)殖和海捕的青蛤、泥蚶、貽貝、牡蠣、扇貝、縊蟶6 個(gè)品種共30 份貝類樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，被測樣品中均未檢出此3種BTX。

3 結(jié) 論

本文以丙酮為提取劑，建立了固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析貝類中3種BTX的方法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，方法檢出限為1.0 μg/kg，定量下限為3.0 μg/kg，平均回收率為80.0%～87.5%，RSD為1.3%～5.4%。該方法穩(wěn)定可靠，靈敏度高，滿足目前對BTX的檢測需要，具有推廣應(yīng)用價(jià)值，有利于海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測和污染源的調(diào)查追蹤。