劉?涵，陳曉楓，劉曉娟,*，賀麗蘋,3，曹 庸

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測試中心，廣東 廣州 510642）

蝦青素是一種酮式類胡蘿卜素，廣泛存在于藻類、蝦類、蟹類、貝類、魚類等食物中，是類胡蘿卜素中近些年來備受關(guān)注的“超級(jí)抗氧化劑”，同時(shí)還具有抗衰老、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[1-3]。蝦青素分子的線性部分含有多個(gè)雙鍵，每個(gè)雙鍵都可以是順式或反式，因此蝦青素有全反式、9-順式、13-順式、15-順式、9,13-順式、13,15-順式、9,15-順式和9,13,15-順式等多種幾何異構(gòu)體，其中全反式結(jié)構(gòu)因空間位阻最小而最穩(wěn)定（圖1）。自然界中的蝦青素大部分以全反式結(jié)構(gòu)為主，但在食品加工/貯藏過程（加熱或光照）中或受環(huán)境因素（高壓、有機(jī)溶劑、金屬離子等）影響會(huì)異構(gòu)化為其順式異構(gòu)體，主要異構(gòu)化為9-順式和13-順式異構(gòu)體[4-6]。不同幾何構(gòu)型蝦青素對動(dòng)物和人體健康是否有不良影響目前尚無定論[7]。因此，自然界中的蝦青素以不同幾何構(gòu)型存在，有必要明確其不同的生物學(xué)活性。

圖1 3 種常見的蝦青素幾何異構(gòu)體結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of three common geometric isomers of astaxanthin

目前，國內(nèi)外學(xué)者對于不同幾何構(gòu)型蝦青素的抗氧化活性開展了一些研究。Liu Xuebo等利用清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、紅細(xì)胞模型、大鼠微粒體模型、亞油酸模型以及人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y模型等方法，比較了全反式、9-順式和13-順式蝦青素的抗氧化活性，提出了蝦青素順式構(gòu)型尤其是9-順式的抗氧化活性最強(qiáng)[8]。金興江等比較了不同構(gòu)型蝦青素清除DPPH自由基、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）自由基和超氧陰離子自由基（O2－·）的能力，發(fā)現(xiàn)9-順式蝦青素清除DPPH自由基和ABTS自由基能力最強(qiáng)，13-順式蝦青素清除O2－·的能力更優(yōu)[9]。孫偉紅的研究表明，13-順式蝦青素對DPPH自由基的清除能力和還原力最強(qiáng)，9-順式蝦青素對二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）過氧化的抑制作用最強(qiáng)[10]。因此，目前對于不同幾何構(gòu)型蝦青素的抗氧化活性還存在一定的爭議，有必要進(jìn)一步對不同幾何構(gòu)型蝦青素的抗氧化活性進(jìn)行深入研究。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）由于具有廉價(jià)、易培養(yǎng)、生命周期短、全基因組序列明確、與人類基因同源性高等優(yōu)點(diǎn)，成為抗氧化、延緩衰老研究首選的模式生物[11-14]。本實(shí)驗(yàn)采用體外（DPPH自由基、ABTS自由基和氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC））和體內(nèi)（秀麗隱桿線蟲模型）相結(jié)合的方法，進(jìn)一步開展不同幾何構(gòu)型蝦青素的抗氧化和對氧化應(yīng)激損傷影響的研究，揭示蝦青素構(gòu)效關(guān)系，為人們合理食用富含蝦青素的食品或保健品提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型秀麗隱桿線蟲（the Bristol strain N2），雌雄同體，由北京市生命科學(xué)研究院惠贈(zèng)；大腸桿菌（Escherichia coli）OP50由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院惠贈(zèng)，OP50為尿嘧啶合成缺陷菌株。

全反式蝦青素由廣東巨元生化有限公司惠贈(zèng)，純度為（97.0f0.5）%；9-順式和13-順式蝦青素由全反式蝦青素通過碘光照法轉(zhuǎn)化而成，再經(jīng)過制備液相色譜分離純化得到純度大于95%的單一順式構(gòu)型。DPPH、ABTS、熒光素鈉（fluorescein，F(xiàn)L）試劑、水溶性VE（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）（純度≥97%）、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸（2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）、二氯百草枯（paraquat，PQ）和2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCF-DA） 美國Sigma-Aldrich有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL 104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Enspire2300多功能酶標(biāo)儀 美國PE公司；UV3010紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立集團(tuán)；L530型臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HZQ-C水浴振蕩器 常州澳華儀器廠；LRH生化培養(yǎng)箱上海申生科技有限公司；SMZ-T4連續(xù)變倍體視顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；LC-8A制備型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）日本島津公司；LC-15C分析型HPLC 日本島津公司；1290-6540 HPLC-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜（atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometers，APCI-MS）美國安捷倫公司；R204B3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 順式蝦青素的制備、構(gòu)型鑒定和純度檢測

1.3.1.1 碘光照法進(jìn)行全反式蝦青素的順式轉(zhuǎn)化

將全反式蝦青素溶于2 000 mg/L二氯甲烷，并配制0.6 mg/mL的碘-二氯甲烷溶液，將兩種溶液按照1∶2（V/V）比例混合。距40 W日光燈60 cm處照射60 min，然后將1 mol/L硫代硫酸鈉溶液以體積比1∶1加入溶液中，攪拌后靜置5 min，去除上清液，重復(fù)1 次，去除多余的碘。剩余溶液在避光條件下，25 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 mL，氮吹至干，－20 ℃保存。選擇制備液相色譜對不同順式蝦青素進(jìn)行分離，液相色譜條件如下：制備液相色譜柱為PRC-ODS（K）柱（250 mmh30 mm，15 μm），流動(dòng)相為甲醇-乙腈-二氯甲烷（體積比14∶1∶1）（A）、純水（B），洗脫時(shí)A泵比例為90%，B泵為10%，運(yùn)行時(shí)間120 min。將前期轉(zhuǎn)化好的樣品用甲醇溶解，制成25 mg/mL的溶液，過0.22 μm的有機(jī)濾膜后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 mL。分別收集55 min和58 min的樣本，通過分析液相色譜檢測其純度。

1.3.1.2 順式蝦青素的構(gòu)型鑒定

將碘光照后的樣品，配制成一定的濃度，利用HPLC-APCI-MS鑒定HPLC圖各峰對應(yīng)的一級(jí)MS圖。同時(shí)采用HPLC-二極管陣列檢測器（HPLC photo-diode array，HPLC-PDA），測定HPLC圖上不同時(shí)間的峰對應(yīng)的電子吸收光譜。

1.3.1.3 順式蝦青素的純度鑒定

選擇HPLC法對順式蝦青素進(jìn)行檢測，分析柱為Diamonsil C18柱（250 mmh4.6 mm，5 μm），檢測器為PDA，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-二氯甲烷-水（體積比85∶5∶5∶5），柱溫25 ℃。流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 不同幾何構(gòu)型蝦青素體外抗氧化活性測定

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參照文獻(xiàn)[15]。將9-順式、13-順式和全反式蝦青素用無水乙醇分別配制成質(zhì)量濃度100、80、60、40、20、10 μg/mL的樣品溶液。測定時(shí)，在96 孔板中加入2h10－4mol/L的DPPH乙醇溶液100 μL，然后再分別加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液100 μL，搖勻后，室溫黑暗處放置30 min，測定517 nm波長處的吸光度At。同時(shí)，測定100 μL樣品溶液＋100 μL乙醇溶液在517 nm波長處的吸光度Ar，再測定100 μL DPPH溶液＋100 μL乙醇在517 nm波長處的吸光度A0。同一測定設(shè)計(jì)3 個(gè)平行，DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

1.3.2.2 ABTS自由基清除能力的測定

ABTS自由基清除能力的測定參照文獻(xiàn)[16]。將5 mL 7 mmol/L ABTS和88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀混合，室溫、避光條件下靜置過夜（12 h），制成ABTS儲(chǔ)備液。該儲(chǔ)備液在室溫、避光的條件下穩(wěn)定，使用前用無水乙醇稀釋成工作液，使其在30 ℃、734 nm波長處的吸光度為0.70f0.02。

將9-順式、13-順式和全反式蝦青素用無水乙醇配制成質(zhì)量濃度100、80、60、40、20、10 μg/mL的樣品溶液。測定時(shí)，在96 孔板中加入ABTS工作液100 μL，然后再分別加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液100 μL，振蕩混勻，10 min后測定其在734 nm波長處的吸光度At，以100 μL ABTS工作液＋100 μL無水乙醇作空白（吸光度記為A0），測定100 μL樣品溶液＋100 μL無水乙醇吸光度Ar。同一測定設(shè)計(jì)3 個(gè)平行，ABTS自由基清除率按式（2）計(jì)算。

1.3.2.3 ORAC的測定

ORAC的測定參照文獻(xiàn)[17]。精密吸取FL稀釋液（8.4h10－8mmol/L）100 μL于96 孔熒光板中，再加入100 μL甲醇，以激發(fā)波長490 nm、發(fā)射波長514 nm進(jìn)行測定并記錄熒光值（記為A0）。在96 孔板上加入FL稀釋液100 μL，再加入不同濃度的Trolox溶液50 μL，振蕩，37 ℃溫育10 min后迅速加入50 μL AAPH液啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)過程中每隔2 min（Δt）測定一次熒光值（記為An）。直至熒光值衰減至直線。按式（3）計(jì)算熒光衰退曲線下的面積（area under curve，AUC），按式（4）計(jì)算保護(hù)面積（Net AUC），以Trolox溶液濃度為橫坐標(biāo)，以Net AUC為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取2.000 mg 9-順式、13-順式和全反式蝦青素，用甲醇溶解，配制成5 μg/mL的樣品溶液，按上述方法進(jìn)行測定與計(jì)算，同一測定設(shè)計(jì)3 個(gè)平行。ORAC以每克樣品等同Trolox的物質(zhì)的量來表示。

1.3.3 不同幾何構(gòu)型蝦青素對秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激損傷的影響

1.3.3.1 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)和同期化

將秀麗隱桿線蟲放置在涂有大腸桿菌OP50的線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM）上，在生化培養(yǎng)箱中（溫度20 ℃，相對濕度40%～60%）培養(yǎng)。采用高氯酸鈉裂解法對秀麗隱桿線蟲進(jìn)行同期化[18]。用1 mL M9緩沖溶液將NGM平板上年輕成蟲充分沖洗，轉(zhuǎn)移至2 mL無菌EP管中，加入1 mL現(xiàn)配裂解液，充分振蕩5～10 min后，在低速離心機(jī)上以3 000 r/min離心1 min，棄上清液，再用1 mL M9緩沖液沖洗線蟲以同樣條件離心2 次，棄上清液，余下0.3～0.4 mL后混勻緩沖液和蟲卵，用移液槍吸取EP管底部液體滴于NGM平板邊緣的無菌區(qū)，后稍傾斜平板旋轉(zhuǎn)一周。約48 h后線蟲受精卵基本發(fā)育成L4期幼蟲，完成同期化。

1.3.3.2 PQ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷條件下線蟲存活率檢測

9-順式、13-順式和全反式蝦青素用二甲基亞砜配制成0.16 mmol/L，取95 μL E. coli OP50菌液和5 μL二甲基亞砜混合均勻，涂布在NGM上。經(jīng)藥物處理96 h后，分別從藥物組和對照組將線蟲挑入96 孔板中，每孔3 只，每組3 孔，每組重復(fù)做3 次。每個(gè)孔預(yù)先加入100 μL M9緩沖液（含E. coli OP50菌液，PQ濃度為10 mmol/L），每隔24 h記錄線蟲生存、死亡數(shù)，直至線蟲全部死亡。線蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)為用鉑金絲輕觸蟲體時(shí)，無任何反應(yīng)[19]。

1.3.3.3 PQ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷條件下線蟲活性氧檢測

經(jīng)藥物處理96 h后，分別從藥物組和對照組將線蟲挑入96 孔板中（每孔80 條，3?個(gè)平行），加入100 μL M9緩沖液（含E. coli OP50菌液，PQ濃度為10 mmol/L）處理24 h后，加入50 μL用M9緩沖液配制的100 μmol/L的H2DCF-DA溶液；用50 μL不含線蟲的H2DCF-DA溶液和50 μL M9緩沖液作為空白對照。立即將96 孔板放入酶標(biāo)儀中測定熒光強(qiáng)度，反應(yīng)溫度25 ℃，發(fā)射波長528 nm、激發(fā)波長485 nm[20]。每隔20 min測定一次，反應(yīng)6 h，每次讀數(shù)前振蕩。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均采用3?次平行處理，數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，不同處理組之間的差異用多重比較分析（Duncan）單因素方差分析（One-way analysis of variance，One-way ANOVA）進(jìn)行處理，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素幾何構(gòu)型的鑒定和純度檢測

對于蝦青素幾何構(gòu)型的鑒定，國內(nèi)外普遍采用HPLC-APCI-MS和Q值進(jìn)行鑒定[9,21]。

2.1.1 通過HPLC-APCI-MS鑒定各峰分子質(zhì)量

圖2 反式蝦青素碘光照處理后的高效液相色譜圖（A）以及1號(hào)峰（B）、2號(hào)峰（C）和3號(hào)峰（D）對應(yīng)的高效液相色譜-質(zhì)譜圖Fig.2 High performance liquid chromatograms of all-trans astaxanthin after iodine-light treatment (A) and high performance liquid chromatography-mass spectrometric analysis of peak 1 (B), 2 (C) and 3 (D)

采用碘光照法對全反式蝦青素進(jìn)行順式轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的液相色譜圖如圖2A所示，1號(hào)峰為全反式蝦青素，2號(hào)峰和3號(hào)峰為轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)的兩個(gè)新峰。分別對圖2A中的3 個(gè)峰進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜檢測，從圖2B～D可以看出，1、2、3號(hào)峰的質(zhì)荷比（m/z）均約為597.39，即3 個(gè)峰的分子質(zhì)量均與蝦青素有相同的質(zhì)荷比，從而推斷這3 種物質(zhì)為蝦青素的同分異構(gòu)體。

2.1.2 Q值的檢測

利用PDA檢測器，可以看到不同峰在一定波長范圍內(nèi)的吸光度變化。一般順式異構(gòu)體的溶液在電子吸收光譜中除了主要的吸收峰外，還會(huì)在300～400 nm波長處出現(xiàn)一吸收峰，被稱之為“順式峰”，順式峰的吸光度與主峰的吸光度的比值定義為Q值，根據(jù)Q值來判斷蝦青素的幾何構(gòu)型。圖3A～C分別為1、2、3號(hào)峰的PDA掃描圖，由圖3A可以看出，1號(hào)峰（已知為全反式蝦青素），最大吸收波長在470 nm左右，該波長為蝦青素的最大吸收波長。圖3B、C中，2號(hào)峰和3號(hào)峰的最大吸收波長也在470 nm，并且存在順式峰。計(jì)算1、2、3號(hào)峰對應(yīng)的Q值，分別為0.09、0.11和0.55。Q值越大，發(fā)生在C鏈中間異構(gòu)的概率越大。因此，判斷1、2、3號(hào)峰分別為全反式、9-順式和13-順式蝦青素。

圖3 1號(hào)峰（A）、2號(hào)峰（B）和3號(hào)峰（C）電子吸收光譜圖Fig.3 Electronic absorption spectra of peak 1 (A), 2 (B) and 3 (C)

2.1.3 分離制備的順式蝦青素的純度檢測

不同幾何構(gòu)型蝦青素的分離純化主要通過制備液相色譜來實(shí)現(xiàn)，從制備液相色譜中獲得對應(yīng)峰的樣品，經(jīng)過萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥，得到純度較高的9-順式和13-順式樣品，純度分別達(dá)到95%和90%（圖4）。

圖4 9-順式（A）和13-順式（B）蝦青素高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatograms of 9-cis (A) and 13-cis (B) astaxanthin

2.2 不同幾何構(gòu)型蝦青素的體外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

從圖5A可以看出，9-順式、13-順式和全反式蝦青素對DPPH自由基的清除率都隨著質(zhì)量濃度的增大而提高，蝦青素在質(zhì)量濃度20～100 μg/mL范圍內(nèi)，9-順式對DPPH自由基清除率質(zhì)量濃度高于13-順式和全反式。從圖5B來看，不同幾何構(gòu)型蝦青素清除DPPH自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）沒有顯著區(qū)別，從而表明不同幾何構(gòu)型蝦青素在清除DPPH自由基能力方面沒有顯著性差異（P＜0.05）。

圖5 不同幾何構(gòu)型蝦青素DPPH自由基清除率（A）和IC50（B）Fig.5 DPPH radical scavenging capacity (A) and IC50 (B) of different geometric isomers of astaxanthin

2.2.2 ABTS自由基清除能力

圖6 不同幾何構(gòu)型蝦青素ABTS自由基清除率（A）和IC50（B）Fig.6 ABTS radical scavenging capacity (A) and IC50 (B) of different geometric isomers of astaxanthin

從圖6A可以看出，9-順式、13-順式和全反式蝦青素對ABTS自由基的清除率都隨著質(zhì)量濃度的增大而提高，不同幾何構(gòu)型蝦青素質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL范圍內(nèi)清除ABTS自由基能力的順序?yàn)椋?-順式＞13-順式＞全反式。比較不同幾何構(gòu)型蝦青素清除ABTS自由基的IC50，從圖6B可以看出，9-順式蝦青素清除ABTS自由基的IC50（26.14 μg/mL）顯著低于13-順式（43.81 μg/mL）和全反式蝦青素（39.77 μg/mL）（P＜0.05）。

2.2.3 ORAC結(jié)果

圖7 不同幾何構(gòu)型蝦青素的ORACFig.7 Oxygen radical absorbance capacity of different geometric isomers of astaxanthin

根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.077x－1.031（R2＝0.990）計(jì)算不同幾何構(gòu)型蝦青素的ORAC，由圖7可以看出，3 種不同幾何構(gòu)型蝦青素的總抗氧化能力的順序?yàn)椋?-順式＞全反式＞13-順式，其中9-順式的ORAC（990.81 μmol/g）顯著高于13-順式（830.72 μmol/g）（P＜0.05），與全反式蝦青素處理組之間無明顯差異（P＞0.05）。

目前，主要通過化學(xué)方法來評價(jià)類胡蘿卜素的體外抗氧化活性。蝦青素分子結(jié)構(gòu)和其他類胡蘿卜素一樣具有共軛雙鍵長鏈，并且它的共軛雙鍵鏈末端還有不飽和的酮基和羥基，構(gòu)成α-羥基酮，這些結(jié)構(gòu)都具有較活潑的電子效應(yīng)，能向自由基提供電子或吸引自由基，從而清除自由基[22]。因此，大部分類胡蘿卜素的體外抗氧化評價(jià)方法是以清除自由基為基礎(chǔ)的，如DPPH法、ABTS法、ORAC法等[23]。本研究采用以清除自由基為基礎(chǔ)的3 種方法對不同幾何構(gòu)型蝦青素體外抗氧化活性進(jìn)行綜合評價(jià)。結(jié)果表明，在清除DPPH自由基方面，3 種不同幾何構(gòu)型之間均沒有顯著差異（P＞0.05）；在清除ABTS自由基方面，9-順式蝦青素顯著高于13-順式和全反式蝦青素（P＜0.05）；在ORAC方面，9-順式蝦青素顯著高于13-順式（P＜0.05），13-順式蝦青素和全反式蝦青素之間沒有顯著差異（P＞0.05）。3 種評價(jià)方法結(jié)果存在差異，可能是因?yàn)椴煌u價(jià)方法的作用原理不同：在DPPH方法中，當(dāng)氫原子或電子被轉(zhuǎn)移到帶奇數(shù)電子的DPPH自由基中，會(huì)形成非自由基型DPPH-H，DPPH自由基在517 nm波長處的吸光度會(huì)隨著DPPH-H的形成而成比例減少[24]；ABTS自由基比DPPH自由基活性高，自由基的變化主要涉及電子轉(zhuǎn)移過程[25]；ORAC法模擬了體內(nèi)環(huán)境中抗氧化物與自由基反應(yīng)的情況，表示的是抗氧化物在特定的生理pH值下對生物化學(xué)自氧化產(chǎn)生的氧自由基的抑制作用，ORAC實(shí)驗(yàn)反應(yīng)過程是一個(gè)經(jīng)典的氫原子轉(zhuǎn)移的氧化過程[26]。

2.3 不同幾何構(gòu)型蝦青素對秀麗隱桿線蟲氧化劑應(yīng)激的影響

2.3.1 不同幾何構(gòu)型蝦青素對PQ誘導(dǎo)氧化損傷線蟲存活率的影響

氧化損傷被認(rèn)為是許多疾病及衰老過程的一個(gè)主要病理、生理學(xué)因素，機(jī)體的過氧化是由于活性氧（reactive oxygen species，ROS）和抗氧化防御系統(tǒng)之間的不平衡所導(dǎo)致的，過量ROS容易損害脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及DNA等細(xì)胞大分子，從而破壞細(xì)胞的完整性和功能[27]。過氧化可誘導(dǎo)產(chǎn)生病理性蛋白聚合物，從而誘發(fā)各種神經(jīng)變性疾病，如帕金森病和阿爾茨海默病；過氧化會(huì)引起基因組突變，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要原因；另外，過氧化還會(huì)引起線粒體損傷[28]。近年來，秀麗隱桿線蟲在研究氧化誘導(dǎo)損傷方面已成為重要的模式生物。

采用PQ處理秀麗隱桿線蟲來模擬內(nèi)源性的氧化應(yīng)激損傷。PQ進(jìn)入線蟲體內(nèi)，消耗大量的NADPH，使NADPH參與的生化反應(yīng)不能正常進(jìn)行，競爭性抑制干擾呼吸鏈的電子傳遞，影響氧化磷酸化，一些電子與分子氧作用形成O2－·，O2－·很快被超氧化物歧化酶轉(zhuǎn)化成H2O2，后者被過氧化氫酶轉(zhuǎn)化成H2O。此外，H2O2也可以自由地在線粒體和細(xì)胞質(zhì)之間自由擴(kuò)散，形成羥自由基（·OH）和氫氧根離子（OH－）等更多的自由基，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷[19]。當(dāng)線蟲體內(nèi)的抗氧化酶不足以抵抗內(nèi)源性或外源性的氧化應(yīng)激損傷時(shí)，需要加入外源的抗氧化劑來輔助機(jī)體對抗過多的ROS。因此，本實(shí)驗(yàn)以PQ為誘導(dǎo)劑，將正常培養(yǎng)96 h后的處理組和對照組進(jìn)行處理，模擬氧化損傷環(huán)境，記錄經(jīng)PQ處理后各組秀麗隱桿線蟲的存活數(shù)，計(jì)算其存活率。

圖8 不同幾何構(gòu)型蝦青素對PQ氧化損傷后線蟲存活率的影響Fig.8 Effects of different geometric isomers of astaxanthin on the survival rate of Caenorhabditis elegans under oxidative damage induced by PQ

如圖8所示，不同處理組中秀麗隱桿線蟲的存活率都隨著時(shí)間的延長而降低，與對照組相比，9-順式、13-順式和全反式蝦青素均能顯著提升線蟲在不同時(shí)間的存活率（P＜0.05），但三者之間對線蟲存活率的提升不存在顯著差異（P＞0.05）。

2.3.2 不同幾何構(gòu)型蝦青素對PQ誘導(dǎo)氧化損傷線蟲體內(nèi)ROS積累量的影響

過剩的ROS是衰老的主要原因，在氧化損傷環(huán)境下，秀麗隱桿線蟲細(xì)胞線粒體電子傳遞鏈會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，線蟲體內(nèi)ROS的積累量與熒光物質(zhì)2’,7’-二氯熒光素的生成量成正比。實(shí)驗(yàn)測定了3 種幾何構(gòu)型蝦青素和對照組經(jīng)PQ誘導(dǎo)氧化損傷后線蟲體內(nèi)ROS的積累量。

圖9 不同幾何構(gòu)型蝦青素對PQ氧化損傷后線蟲體內(nèi)ROS積累量的影響Fig.9 Effects of different geometric isomers of astaxanthin on ROS accumulation in Caenorhabditis elegans under oxidative damage induced by PQ

如圖9所示，與對照組相比，9-順式蝦青素組和全反式蝦青素組線蟲體內(nèi)的ROS積累量顯著下降（P＜0.05），分別下降了56.05%和15.07%。9-順式蝦青素組對體內(nèi)的ROS積累量的降低與全反式蝦青素組和13-順式蝦青素組相比均有顯著差異（P＜0.05）。9-順式蝦青素在氧化誘導(dǎo)損傷線蟲存活率方面高于13-順式和全反式，可能與9-順式蝦青素具有較強(qiáng)的清除線蟲體內(nèi)ROS積累量有關(guān)。

綜合體外抗氧化實(shí)驗(yàn)和對秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，9-順式蝦青素的活性顯著高于全反式和13-順式蝦青素。然而，目前還沒有一種確切的機(jī)制來解釋它們之間存在抗氧化和改善氧化應(yīng)激損傷差異的原因。根據(jù)量子化學(xué)的前線軌道理論，分子參與反應(yīng)最先起作用的是前線軌道，即分子中的最高電子占有分子軌道和最低空分子軌道。能量差是分子穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，差值越大，分子穩(wěn)定性越強(qiáng)。反之，分子越不穩(wěn)定，越易參與化學(xué)反應(yīng)[29]。Levin等的研究顯示，9-順式β-胡蘿卜素的能量差更大，因此更易與自由基發(fā)生反應(yīng)[30]。因此推斷9-順式蝦青素比其他兩種幾何構(gòu)型蝦青素的能量差更大，更容易起到抗氧化作用。在一個(gè)關(guān)于蝦青素口服藥代動(dòng)力學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，人類的血液會(huì)選擇性地吸收較多的順式蝦青素，但卻有較多的全反式蝦青素在極低密度脂蛋白和酪氨酸微粒中顯著分布[31]。

3 結(jié) 論

研究表明，9-順式蝦青素在體外清除ABTS自由基和ORAC及保護(hù)秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激損傷方面，都顯著優(yōu)于13-順式蝦青素和全反式蝦青素，13-順式蝦青素和全反式蝦青素的抗氧化和對氧化應(yīng)激的保護(hù)作用差異不顯著。關(guān)于不同構(gòu)型蝦青素抗氧化活性存在差異的機(jī)理目前還未明確，還有待于進(jìn)一步采用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型開展深入研究，研究結(jié)果對于闡明不同構(gòu)型蝦青素的構(gòu)效關(guān)系提供了重要資料，為人們合理食用富含蝦青素類食品提供指導(dǎo)。