李麗杰，賀 敏，賀銀鳳,*，孫 禹

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古包頭市疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

重金屬是指密度大于5的金屬，不同領(lǐng)域?qū)χ亟饘俚囊?guī)定不同，一般來說，多半是以環(huán)境污染領(lǐng)域的定義為準(zhǔn)，包括汞、鎘、鉛、鉻、鋅、銅、鈷、砷等。重金屬不僅可以通過水體、空氣、土壤等污染環(huán)境使生態(tài)問題惡化，而且會(huì)導(dǎo)致食品中的有毒重金屬殘留蓄積，引起嚴(yán)重的食品安全問題，在造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)嚴(yán)重威脅人類健康。

對(duì)于去除環(huán)境及食品中的重金屬污染問題，微生物吸附因其具有無污染、成本低等優(yōu)點(diǎn)已成為廣泛認(rèn)可的重金屬脫除方法。目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)酵母菌對(duì)重金屬具有良好的吸附能力和抗性，其中有些酵母菌可以在食品發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用，而這類微生物對(duì)重金屬的脫除及解毒機(jī)制更是最新的研究熱點(diǎn)。

目前，關(guān)于酵母菌對(duì)重金屬解毒機(jī)制的研究主要集中于如何通過胞外的吸附、沉淀等作用緩解重金屬的毒性，但對(duì)重金屬脅迫下酵母菌細(xì)胞內(nèi)對(duì)重金屬的抗性及其解毒機(jī)制進(jìn)展的報(bào)道較少。本文介紹酵母菌對(duì)重金屬的抗性及吸附情況，闡述不同種、屬對(duì)不同類別重金屬的去除情況，重點(diǎn)從胞內(nèi)分子角度分析了酵母菌對(duì)重金屬的抗性機(jī)制，歸納了解毒過程中關(guān)鍵性的基因和蛋白質(zhì)以及它們的功能作用，旨在為有活性的酵母菌應(yīng)用于生態(tài)環(huán)境和被重金屬污染的發(fā)酵食品提供理論依據(jù)。

1 酵母菌對(duì)重金屬的吸附與抗性情況

酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬中的多種酵母菌對(duì)重金屬具有很高的抗性，并且有一些是良好的重金屬吸附劑。對(duì)于酵母屬中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）吸附重金屬的研究較早也比較廣泛，主要集中于測(cè)定釀酒酵母對(duì)不同重金屬離子的吸附情況。相關(guān)研究表明，釀酒酵母對(duì)Cd2＋、Pb2＋、Cu2＋、Co2＋、Al3＋、U4＋、Zn2＋、Cr3＋、Ni2＋等重金屬離子具備較強(qiáng)的吸附能力，吸附的基質(zhì)主要是廢水和液體培養(yǎng)基[1-3]。

近幾年，對(duì)其他菌屬酵母菌吸附及抗重金屬的研究也逐漸深入，主要是從不同的生態(tài)環(huán)境中篩選吸附和抗重金屬的酵母菌，并且對(duì)其吸附及抗性進(jìn)行研究，包括菌體濃度、重金屬濃度及其他離子存在對(duì)其吸附及抗性的影響等。重金屬鎘在自然界中廣泛殘留，所以酵母菌對(duì)鎘的吸附和抗性研究最為深入。眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)紅酵母（Rhodotorula sp.）Yll、馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）YS-K1、魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、南極紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）AN5、土生隱球酵母（Cryptococcus humicola）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）PS33等在不同菌體添加量下，分別在3～1 232 mg/L Cd2＋溶液中具有很高的鎘抗性與積累特性[4-9]，同時(shí)某些菌種具有很強(qiáng)的鎘脫除能力，在一定條件下去除率可以達(dá)到90%以上，明顯高于釀酒酵母[4-5,8-9]。魏軻研究發(fā)現(xiàn)，以上部分菌株除對(duì)重金屬鎘有一定的吸附和抗性外，南極紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）AN5在含有極高濃度的CuSO4、CuCl2、Pb（CH3COO）2、CrCl3、MnCl2和HgCl2等重金屬的培養(yǎng)基中也可以存活并緩慢生長(zhǎng)[6]。而Fernández等也證明分別有55%和80%從南極分離的南極酵母能夠抵抗1 mmol/LCr3＋和Cu2＋[7]。據(jù)Andreeva等的報(bào)道，土生隱球酵母（Cryptococcus humicola）對(duì)濃度為2.502 mmol/L的Mn2＋、Co2＋、Ni2＋、Zn2＋、La3＋也具有抗性[10]；在含有葡萄糖、磷酸鹽和2 mmol/L金屬鹽的培養(yǎng)基中，除鎘外其還可以積累鈷和鐵，去除率分別約為17%和4%[11]。

表1 酵母菌對(duì)重金屬的吸附及抗性情況Table1 Heavy metal biosorption by yeasts and their resistance to heavy metals

另外，Oladunjoye等發(fā)現(xiàn)耶氏酵母屬（Yarrowia spp.）中的菌株Idd1和Idd2通過生物累積、揮發(fā)和微量沉淀可去除培養(yǎng)基中97%以上的汞[12]。Bankar等對(duì)兩種海洋解脂耶氏酵母菌株的重金屬抗性進(jìn)行測(cè)定后推測(cè)，兩種解脂耶氏酵母對(duì)Pb2＋、Cr3＋、Zn2＋、Cu2＋、As5＋、Ni2＋等均具有抗性[13]。Radi?等從來自郊區(qū)和城市污染的土壤中分離出熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）和西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis），這兩種酵母在2 mmol/L CuSO4g5H2O存在下能大量生長(zhǎng)，顯示出對(duì)銅的抗性[14]。而Ilyas等從工業(yè)廢水中分離出的熱帶假絲酵母PS33同樣顯示出對(duì)35 mmol/L Pb2＋、29 mmol/L As5＋、23 mmol/L Cu2＋、8 mmol/L Cr2＋具有一定的抗性。培養(yǎng)8 d后，熱帶假絲酵母PS33能從培養(yǎng)基中除去70% As2＋、82% Cu2＋、65% Cr3＋和87% Pb2＋[15]（表1）。

本實(shí)驗(yàn)室從內(nèi)蒙古重金屬污染區(qū)分離篩選出對(duì)重金屬鉛具有不同抗性和吸附能力的酵母菌，并且通過研究發(fā)現(xiàn)，菌株對(duì)重金屬的抗性與吸附性間不存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。其中低抗鉛的2 株金佩梅奇酵母（Metschnikowia chrysoperlae）對(duì)Pb2＋的去除率高達(dá)92.56%以上，而高抗鉛的3 株膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）對(duì)Pb2＋的去除率最高卻僅為23.14%。人們更希望獲得高抗及高吸附性的菌株用于對(duì)重金屬的去除，具有高抗性的酵母菌才能在重金屬污染的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖并保持活性，從而更好地發(fā)揮微生物對(duì)重金屬的吸附及解毒作用。因此本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的對(duì)Pb2＋的抗性質(zhì)量濃度在6 000～7 000 mg/L之間、去除率可達(dá)78.94%～91.67%的4 株高抗、高吸附性的異常威客漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）具備一定的應(yīng)用潛力，也是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

2 酵母菌解毒重金屬的胞內(nèi)分子機(jī)制

目前，在對(duì)重金屬胞內(nèi)解毒分子機(jī)制研究方面，釀酒酵母作為第一個(gè)被全基因組測(cè)序的真核模式生物，是唯一已經(jīng)闡明機(jī)制的酵母菌。而對(duì)于其他酵母菌解毒重金屬胞內(nèi)機(jī)制的研究不盡相同?？偨Y(jié)起來，酵母菌解毒重金屬的機(jī)制包括酵母菌含硫代謝通路的重構(gòu)/谷胱甘肽合成機(jī)制、與緩解氧化應(yīng)激相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)、將重金屬從胞內(nèi)運(yùn)出或使其封閉在液泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的運(yùn)輸作用、與重金屬離子結(jié)合降低其毒性的金屬硫蛋白和植物螯合肽的結(jié)合作用等。

2.1 谷胱甘肽合成的解毒機(jī)制

硫吸收和谷胱甘肽生物合成對(duì)于所有生物體都是必需的。谷胱甘肽是防御氧化應(yīng)激和重金屬解毒的關(guān)鍵因素，其以以下4 種方式進(jìn)行重金屬解毒：1）結(jié)合重金屬生成復(fù)雜的蛋白質(zhì)，從而介導(dǎo)液泡隔離；2）具有抗氧化作用，可以緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激；3）可能與蛋白質(zhì)上的活性巰基結(jié)合（即蛋白質(zhì)谷胱甘肽化），從而使它們免于與不可逆的重金屬結(jié)合和/或氧化損傷；4）可以在細(xì)胞外與重金屬螯合形成復(fù)合物，并且這種復(fù)合物不容易再進(jìn)入細(xì)胞。

對(duì)于酵母菌的抗鎘機(jī)制最初是由Lee等研究的，他們發(fā)現(xiàn)反式激活因子Yap1p可以調(diào)節(jié)酵母菌對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，并且在抗鎘方面很重要，原因是Yap1p是谷胱甘肽合成過程中轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)因子[16]。之后，在21世紀(jì)，Vido等利用雙向凝膠電泳技術(shù)分析了酵母細(xì)胞在急性鎘脅迫下的蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)含硫氨基酸生物合成途徑的9 種酶被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，這種誘導(dǎo)同樣依賴于反式激活因子Yap1p[17]。而Fauchon等的研究與Vido等一致，同樣發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的鎘應(yīng)答機(jī)制之一是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Met4p與Yap1p，其通過調(diào)控酵母菌攝取硫以增強(qiáng)谷胱甘肽的合成，從而協(xié)同調(diào)節(jié)谷胱甘肽產(chǎn)生[18]。

Lafaye等進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)定量了鎘處理的釀酒酵母細(xì)胞中8 種涉及谷胱甘肽生物合成途徑的含硫代謝物（即半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、胱硫醚、谷胱甘肽的還原和氧化形式、S-腺苷高半胱氨酸），發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，大部分代謝物的細(xì)胞內(nèi)濃度增加，證明了酵母菌中谷胱甘肽的大量產(chǎn)生對(duì)于重金屬鎘的解毒至關(guān)重要。在重金屬鎘存在的條件下，含硫蛋白質(zhì)的合成顯著下降、含硫代謝物重構(gòu)流向谷胱甘肽通路[19]。Huang Xinhe等進(jìn)一步證明鎘暴露增加了細(xì)胞谷胱甘肽水平、降低了氧化型谷胱甘肽水平，并且還降低了細(xì)胞的氧化型谷胱甘肽/谷胱甘肽比例[20]。

在釀酒酵母的抗砷方面，Thorsen等通過定量轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和硫代謝物分析探討了釀酒酵母的抗砷（亞砷酸鹽）機(jī)制，最重要的結(jié)論是：幾乎所有硫酸鹽同化和谷胱甘肽生物合成途徑的組分均在基因和蛋白質(zhì)水平被誘導(dǎo)。并且確定了核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子為Yap1p和Met4p，與其抗鎘機(jī)制一致[21]。

隨著包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等各層面的組學(xué)研究手段的應(yīng)用，其他能吸附和抗重金屬酵母菌的抗性機(jī)理逐漸被研究。

在粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中的鎘解毒機(jī)制同樣涉及谷胱甘肽，在鎘脅迫下，粟酒裂殖酵母中的硫化物合成也增加，并且硫化物參與具有高鎘結(jié)合能力的高分子質(zhì)量植物螯合肽-鎘-含硫復(fù)合物的產(chǎn)生。Jin等對(duì)粟酒裂殖酵母的鎘和砷抗性基因進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，在36 個(gè)與鎘和砷的抗性均相關(guān)的基因中涉及3 個(gè)生物學(xué)過程，最主要的就是含硫化合物代謝過程，特別是硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸）和谷胱甘肽的生物合成[22]。

除了釀酒酵母和粟酒裂殖酵母的重金屬抗性與谷胱甘肽合成有關(guān)外，Ilyas等從工業(yè)廢水中分離出抗重金屬膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。與對(duì)照組相比，在100 mg/L CdCl2、NaAsO2、CuSO4、Pb（NO3）2的脅迫下，其谷胱甘肽含量均有所增加[23]。而最近Khan等進(jìn)一步驗(yàn)證了鎘誘導(dǎo)下熱帶假絲酵母3Aer中谷胱甘肽生物合成增加[24]。Ilyas通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)另一株假絲酵母PS33經(jīng)0.1 mmol/L砷和鉛處理后，細(xì)胞中谷胱甘肽水平顯著升高[23]。

2.2 與酵母菌解毒重金屬相關(guān)的基因和蛋白

表2 酵母菌中與重金屬解毒相關(guān)的基因Table2 Genes related to heavy metal detoxif i cation in yeasts

Jin等[22]通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白組與代謝組學(xué)技術(shù)以及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在銅、鎘、汞、鋅、鉻、砷等重金屬脅迫下，酵母菌會(huì)產(chǎn)生一些對(duì)重金屬響應(yīng)一致的基因，稱為常見的金屬響應(yīng)（common metal-responsive，CMR）基因。被誘導(dǎo)的CMR基因在與重金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)定、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的解毒、碳水化合物代謝、脂肪酸代謝、多胺轉(zhuǎn)運(yùn)和RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄等相關(guān)的生物過程中被富集，而被抑制的CMR基因在與多糖生物合成、G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)靶向和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的生物過程中富集[22]。另外，在不同重金屬脅迫下，酵母菌不同菌屬基因表達(dá)的變化不同。表2中例舉的基因主要包括緩解重金屬脅迫引起細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)基因、為了修復(fù)重金屬脅迫引起細(xì)胞損傷的DNA損傷和修復(fù)基因、降低胞內(nèi)ROS含量的抗氧化活性基因、維持細(xì)胞壁完整性及編碼各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因等。

表3 酵母菌中與重金屬解毒相關(guān)的蛋白Table3 Proteins related to heavy metal detoxif i cation in yeasts

表3中列舉的蛋白功能同樣主要集中在細(xì)胞防御和拯救、蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、甘油運(yùn)輸、電子傳遞、應(yīng)激反應(yīng)和核糖體生物合成、抗氧化活性、細(xì)胞壁合成、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面。

隨著蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)的推進(jìn)，除了對(duì)釀酒酵母重金屬解毒機(jī)制研究得比較深入外，對(duì)其他酵母菌的抗重金屬機(jī)制的研究也逐漸展開。其中比較深入的是對(duì)粟酒裂殖酵母與重金屬抗性相關(guān)基因和蛋白的研究。Bae等系統(tǒng)研究了粟酒裂殖酵母在鎘脅迫下的細(xì)胞反應(yīng)，并與釀酒酵母進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，鎘暴露后粟酒裂殖酵母80%的上調(diào)蛋白質(zhì)不同于釀酒酵母，在粟酒裂殖酵母中未觀察到誘導(dǎo)半胱氨酸合酶表達(dá)。作為鎘解毒的替代機(jī)制，粟酒裂殖酵母顯著產(chǎn)生更高水平的無機(jī)硫化物，以固定細(xì)胞鎘作為CdS納米晶體覆蓋谷胱甘肽和/或植物螯合物[32]。Guo Lan等[34]對(duì)粟酒裂殖酵母的鎘和砷抗性基因進(jìn)一步進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，輔因子生物特別是泛醌和西羅血紅素、5-磷酸吡哆醛的生物合成與鎘和砷的抗性均相關(guān)。

2.3 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)重金屬的排出和液泡隔離機(jī)制

在酵母菌細(xì)胞膜、線粒體、囊泡、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和細(xì)胞核上都有重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的存在，可以運(yùn)輸多種重金屬。這些蛋白質(zhì)中有的是特異性的、有的是非特異性的，有的介導(dǎo)重金屬的轉(zhuǎn)入、有的介導(dǎo)重金屬的轉(zhuǎn)出，而基本探明的與酵母菌胞內(nèi)解毒重金屬相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)主要有3 類。

2.3.1 位于細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的解毒機(jī)制

位于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過運(yùn)出途徑將重金屬從胞質(zhì)中運(yùn)出，降低重金屬在細(xì)胞中的毒性。Wysocki等證明釀酒酵母中存在促進(jìn)As3＋外排的砷抗性-3（Acr3）p（也稱為Arr3p）和促進(jìn)Cd2＋外排的Pca1p等蛋白，As3＋通過Acr3p輸出可能是釀酒酵母中最重要的砷解毒機(jī)制[35]。Acr3p是Acr3家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的原型成員，其屬于膽汁/亞砷酸鹽/核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。Pca1p是包括各種重金屬如銀、鎘、鈷、銅、鉛和鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是釀酒酵母中鎘輸出的主要途徑，對(duì)鎘抗性起著關(guān)鍵作用[36]。水甘油通道蛋白（Fps1p）是另一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是雙向通道蛋白，是介導(dǎo)As3＋和Sb3＋向酵母細(xì)胞流入和流出的主要途徑。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)As（OH）3濃度高于細(xì)胞外時(shí)，F(xiàn)ps1p可能與Acr3p一起促進(jìn)As3＋從細(xì)胞內(nèi)排出。為了防止通過Acr3p排出的As3＋通過Fps1p重新進(jìn)入，細(xì)胞通過排出谷胱甘肽以降低As（OH）3的細(xì)胞外濃度，細(xì)胞外As3＋和谷胱甘肽形成復(fù)合物，且不能進(jìn)入細(xì)胞[26]。Cui Zhifeng[37]、Nagy[38]等證明Yor1p轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也涉及重金屬解毒，Yor1p屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter protein，ABC）家族，可能介導(dǎo)雙谷胱甘肽鎘（bis-glutathionatocadmium，Cd（GS）2）形式的鎘外排。

2.3.2 位于液泡膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的解毒機(jī)制

位于液泡膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將植物螯合肽-重金屬絡(luò)合物或谷胱甘肽-重金屬絡(luò)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡，通過封閉隔離使重金屬從胞質(zhì)中去除。許多研究表明，在釀酒酵母中，Ycf1p代表了一個(gè)主要液泡隔離途徑。Li Zesheng等通過含有YCF1基因缺失的釀酒酵母菌株DTY167及同基因野生型菌株DTY165之間的直接比較，證明YCF1是增加對(duì)外源谷胱甘肽S-共軛前體的毒性作用抗性所必需的[39]。Ycf1p在體外促進(jìn)As（GS）3、Cd（GS）2和Hg（GS）2以谷胱甘肽絡(luò)合物的形式向液泡轉(zhuǎn)運(yùn)。Paumi等證明兩個(gè)Ycf1p同源物Bpt1p和Vmr1p在鎘的解毒中也發(fā)揮了部分的作用[40]。Khan等進(jìn)一步驗(yàn)證了YCF1基因在熱帶假絲酵母3Aer抗鎘機(jī)制中的作用[24]。另外，袁紅莉推斷在釀酒酵母中像Zrc1p這樣的陽離子擴(kuò)散促進(jìn)劑運(yùn)輸?shù)鞍椎倪\(yùn)輸作用和金屬硫蛋白的結(jié)合作用可能都被包括在內(nèi)，但主要的解毒機(jī)制是經(jīng)過ABC將谷胱甘肽/金屬硫蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入液泡[6]。MacDiarmid等提出陽離子擴(kuò)散促進(jìn)劑家族中的Zrc1p、Cot1p兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將Cd2＋、Co2＋、Zn2＋等二價(jià)陽離子螯合到液泡中[41]。

粟酒裂殖酵母中鎘的抗性涉及HMT1基因編碼抗Cd2＋所必需的ABC，它定位于液泡膜上[42]。含有HMT1的粟酒裂殖酵母液泡膜能夠攝取植物螯合肽-Cd2＋復(fù)合物。Guo Lan等在對(duì)粟酒裂殖酵母的鎘和砷抗性進(jìn)行研究時(shí)也證實(shí)了液泡膜跨膜運(yùn)輸?shù)鞍譎mt1p是一種抗鎘所需的蛋白質(zhì)[34]。

2.3.3 位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的解毒機(jī)制

位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器上的蛋白質(zhì)在重金屬解毒中可能發(fā)揮作用，但是具體作用機(jī)制不明確。MacDiarmid等提出陽離子擴(kuò)散促進(jìn)劑家族中的Zrc1p、Cot1p兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將線粒體內(nèi)的鋅和鎘排出，降低重金屬對(duì)線粒體的毒害作用[41]。另外兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Atm1p和Atm3p可以從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬離子鐵硫蛋白結(jié)合物至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)行某些含金屬離子蛋白輔助因子的組裝，并以某種未知的方式提高宿主的重金屬抗性，其轉(zhuǎn)運(yùn)的重金屬離子主要為鉬[43]，但是其具體作用機(jī)制目前仍不清楚。此外，Lauer[44]、Guo Lan[34]等先后證明存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的P型ATP酶家族成員Pmr1p可能是通過分泌途徑直接參與鎘、錳解毒的蛋白質(zhì)；滲透進(jìn)細(xì)胞的過量陽離子可能是通過Pmr1p的作用迅速泵送，通過分泌囊泡從細(xì)胞排出（圖1）。

圖1 酵母菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)重金屬的解毒機(jī)制[35]Fig.1 Detoxif i cation mechanism of heavy metals in yeast through transport proteins[35]

2.4 金屬硫蛋白和植物螯合肽對(duì)重金屬的螯合作用

細(xì)胞中存在重金屬時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)低分子質(zhì)量的富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)和肽如金屬硫蛋白和植物螯合肽表達(dá)并與其結(jié)合，由毒性較強(qiáng)的離子態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘暂^弱的結(jié)合態(tài)，從而使重金屬的毒性降低[45]。

2.4.1 金屬硫蛋白對(duì)重金屬的螯合作用

金屬硫蛋白是一類含有較多半胱氨酸殘基、分子質(zhì)量較小的金屬結(jié)合蛋白，廣泛存在于多種生物中，是與重金屬抗性和富集能力相關(guān)的蛋白中的一類。

在釀酒酵母中有兩種類型金屬硫蛋白，即Cup1p和Crs5p。很多研究證明，在釀酒酵母中Cup1p的主要生理作用是鎘和銅的解毒，而Crs5p可以結(jié)合銅、鎘特別是鋅[46]。酵母金屬硫蛋白主要參與銅、鋅和鎘的解毒機(jī)制。另外，粟酒裂殖酵母重金屬硫蛋白Zym1p可以螯合鋅，而缺乏Zym1p的細(xì)胞對(duì)鋅和鎘敏感[47]。

Radi?等同時(shí)證明熱帶假絲酵母4TD1101S在銅脅迫下胞內(nèi)金屬硫蛋白產(chǎn)量有一定的增加，推測(cè)金屬硫蛋白在熱帶假絲酵母對(duì)銅的抗性中有一定的作用[14]。而Yang等發(fā)現(xiàn)編碼植物螯合素EC的基因與α-凝集素基因融合的工程化釀酒酵母表現(xiàn)出高效的鎘吸附能力，同時(shí)鎘抗性顯著提高[48]。

近年來，許多研究表明利用基因工程中異源表達(dá)技術(shù)提高酵母菌重金屬抗性是可行的。在釀酒酵母中表達(dá)東南景天（Sedum alfredii）的金屬硫蛋白基因SaMT2后，其鎘抗性和積累能力顯著增強(qiáng)[49]。Ruta等將7 種擬南芥金屬硫蛋白（AtMT1a、AtMT1c、AtMT2a、AtMT2b、AtMT3、AtMT4a和AtMT4b）和4 種天藍(lán)遏藍(lán)菜金屬硫蛋白（NcMT1、NcMT2a、NcMT2b和NcMT3）在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)后，導(dǎo)致釀酒酵母對(duì)Cu2＋、Zn2＋或Cd2＋等重金屬抗性增加[50]。

徐炳政[51]、王穎[52]等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)先后探討了兩種酵母源金屬硫蛋白亞型（MT-1和MT-2）對(duì)急性鉛中毒小鼠、慢性鉛中毒小鼠、慢性汞中毒小鼠的排鉛、排汞、肝臟保護(hù)作用和過氧化損傷修復(fù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，兩種酵母源金屬硫蛋白對(duì)3 種小鼠均具有顯著的排鉛、排汞效果以及良好的氧化損傷保護(hù)作用，且作用效果類似于動(dòng)物源金屬硫蛋白。

2.4.2 植物螯合肽對(duì)重金屬的螯合作用

植物螯合肽是在所有真核生物和一些原核生物中發(fā)現(xiàn)的肽，其由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）3 種氨基酸組成，一般化學(xué)式為（γ-Glu-Cys）n-Gly（n＝2～11）。這些肽由谷胱甘肽通過植物螯合肽合成酶合成。植物螯合肽是構(gòu)成裂殖酵母和中、重金屬解毒的主要途徑，尤其是鎘和砷解毒。植物螯合肽可能通過螯合重金屬來保護(hù)細(xì)胞，從而減少重金屬毒性。Iinouhe等發(fā)現(xiàn)3 種不同的野生型菌株八胞裂殖酵母（Schizosaccharomyces octosporus）、粉狀畢赤酵母（Pichia farinosa）和戴爾有孢圓酵母（Torulaspora debrueckii）均對(duì)鎘有部分抗性，其中八胞裂殖酵母細(xì)胞質(zhì)中鎘和植物螯合肽結(jié)合為復(fù)合物，而粉狀畢赤酵母和戴爾有孢圓酵母細(xì)胞質(zhì)中的鎘和蛋白結(jié)合，類似于釀酒酵母中鎘和金屬硫蛋白的結(jié)合物。這些細(xì)胞質(zhì)中的復(fù)合物分子在上述3 種酵母的鎘抗性中發(fā)揮作用[53]。而Guo Lan等對(duì)粟酒裂殖酵母的鎘和砷抗性基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)與鎘和砷的抗性均相關(guān)的36 個(gè)基因中涉及的第3個(gè)生物學(xué)過程即植物螯合肽生物合成[34]。

3 結(jié) 語

雖然生物吸附法作為新型的重金屬脫除方法已在去除環(huán)境中重金屬方面得到廣泛應(yīng)用，但對(duì)于具有高吸附、高抗性且廣泛應(yīng)用于食品中的酵母菌的研究尚處于探索階段，對(duì)這類酵母菌重金屬解毒的胞內(nèi)分子機(jī)制研究尚不系統(tǒng)和完善。雖然通過新型的各種組學(xué)技術(shù)和分子機(jī)制研究確定了許多與重金屬抗性、重金屬解毒相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)，然而這些蛋白在胞內(nèi)受何種轉(zhuǎn)錄因子激活以及這些蛋白激活后如何作用于靶點(diǎn)的確切機(jī)制并不完全清楚，并且對(duì)涉及重金屬解毒的各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的翻譯后調(diào)控了解較少。因此，對(duì)于酵母菌抗性、吸附及解毒重金屬的機(jī)理還應(yīng)進(jìn)行更為全面和深入的研究。在后續(xù)研究中需從以下方面深入探索：1）進(jìn)一步篩選對(duì)重金屬具有良好吸附特性的酵母菌株，建立優(yōu)勢(shì)菌種庫；2）通過對(duì)酵母菌進(jìn)行組分分離、掩蔽基團(tuán)及添加能量抑制劑等方法，探究酵母菌對(duì)重金屬的作用機(jī)制主要是胞外的被動(dòng)吸附還是胞內(nèi)的主動(dòng)累積；3）分析酵母菌中的各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在轉(zhuǎn)運(yùn)、緩解重金屬離子帶來的氧化應(yīng)激方面起到的關(guān)鍵作用，以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同重金屬結(jié)合后如何轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行外排和細(xì)胞器積累及其作用的分子機(jī)制；4）對(duì)篩選到的對(duì)重金屬有較強(qiáng)去除作用的優(yōu)秀菌株的安全性進(jìn)行探討和評(píng)價(jià)，并探究其在宿主體內(nèi)緩解重金屬中毒的機(jī)制，以期將其應(yīng)用于食品、動(dòng)物和人體中，這在解決環(huán)境污染、食品安全危機(jī)方面有重要的意義。