王藝睿 王會(huì) 戚孟春 董偉 馮曉潔 孫紅

華北理工大學(xué)1口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科教研室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室（河北唐山063000）

破骨細(xì)胞分化與功能異常在牙周炎、骨質(zhì)疏松等多種骨過度吸收疾病中起重要作用［1-2］。抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收是這些疾病治療的重要途徑，因而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的研究很重要。鈣離子∕鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II（Ca2+∕calmodulin- dependent protein kinase II，CaMKII）是胞內(nèi)Ca2+信號傳遞的關(guān)鍵信號分子［3］；在CaMKII 諸多異構(gòu)體中，CaMKIIγ 在破骨細(xì)胞分化中表達(dá)較高［4-5］，提示其作用非常關(guān)鍵；但其具體作用及分子機(jī)制目前尚不清楚。本研究通過構(gòu)建CaMKIIγ 慢病毒干擾載體，研究其對破骨細(xì)胞分化及骨吸收的影響，以探索CaMKIIγ 對破骨細(xì)胞分化的影響，后期分子機(jī)制研究及骨過度吸收性疾病的治療以此為實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)用品 小鼠RAW264.7 細(xì)胞株，上海細(xì)胞庫，中國；核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL），Biovision，美國；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphotase，TRAP）染色試劑盒，Sigma，美國；CaMKIIγ 單克隆抗體，Abcam，日本；PCR 引物，博尚生物，中國；慢病毒載體，上海吉?jiǎng)P基因公司，中國。

1.2 CaMKIIγ 干擾載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染效率測定針對CaMKIIγ 基因編碼序列（NM-001039139），根據(jù)RNAi 設(shè)計(jì)原則篩選3 個(gè)RNAi 靶點(diǎn)，序列分別為：#1，5′-TAGAGTGCTTACGCAAATT-3′；#2，5′-TTGCTGCTGGCGAGTAAAT - 3′ ；#3，5′ - ACGCAGGAATATGCTGCAA-3′。以5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′序列為RNAi 陰性對照。將合成的干擾序列與攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒載體pGCSIL-GFP連接形成#1、#2、#3重組干擾載體，并包裝與輔助載體pHelper 2.0共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞；提取重組病毒液，放置-80 ℃?zhèn)溆?。以上由上海紀(jì)凱基因公司協(xié)助完成。

在感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值分別為1、10、30、50下，用陰性載體轉(zhuǎn)染RAW264.7 細(xì)胞，12 h 后換新鮮培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染5 d 后激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）下觀察GFP 表達(dá)情況，確定最適MOI值，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率（GFP 陽性細(xì)胞數(shù)∕所測細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.3 重組載體干擾效率測定

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 RAW264.7 細(xì)胞按5 × 103∕孔接種到直徑為30 mm 的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。細(xì)胞分為5組，分別為對照組（未用病毒轉(zhuǎn)染）、陰性載體轉(zhuǎn)染組、#1、#2、#3 干擾載體組。轉(zhuǎn)染12 h 后，更換含有50 ng∕mL RANKL、10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化；于第5 天收獲細(xì)胞進(jìn)行干擾效率檢測。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測 5 組細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 儀上進(jìn)行變性、退火、延伸；引物序列：CaMKIIγ（409 bp），正義鏈5′-GCATGTACCC ACAAAGGGGT-3′，反義鏈5′-GCTGGCTCCATACTCTGTAGTTC-3′；β-actin（186 bp），正義鏈5′-GTTG GAGCAAACATCCCCCA-3′，反義鏈5′-CGCGACCAT CCTCCTCTTAG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃15 s，55 ℃20 s，72 ℃20 s，45 cylces。用Rotor-Gene 軟件分析5 組CaMKIIγ mRNA水平，確定#1、#2、#3 病毒mRNA 干擾效率。

1.3.3 Western blot 檢測 提取需測細(xì)胞的總蛋白，測濃度，加上樣緩沖液，100 ℃變性；蛋白上樣后，電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育2 h；對照為β-actin；顯影，用成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白條帶吸光度值，并計(jì)算其與β-actin 吸光度值的比值，作為該組CaMKIIγ 蛋白表達(dá)水平。

1.3.4 CaMKIIγ RNA 干擾對破骨細(xì)胞生成及骨吸收功能的影響 實(shí)驗(yàn)分組：細(xì)胞分為對照組、陰性載體組、干擾載體組（使用干擾效率最佳的干擾載體）。TRAP 檢測：細(xì)胞按5 × 103∕孔接種到30 mm 直徑的培養(yǎng)皿中，按1.3 方法轉(zhuǎn)染并繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)5 d 后，收獲細(xì)胞并按照試劑盒說明書進(jìn)行TRAP 染色，200 倍顯微鏡下觀察。每張細(xì)胞爬片隨機(jī)取6 個(gè)視野，計(jì)算TRAP+且胞核≥3 個(gè)的細(xì)胞數(shù)目，取其平均值；每組測量3 個(gè)細(xì)胞爬片。骨吸收陷窩檢測：用離體牙制備1 mm 厚牙本質(zhì)磨片；細(xì)胞按5 × 103∕孔接種到有牙本質(zhì)磨片的24 孔板中。培養(yǎng)方法同TRAP 染色。7 d 后收獲牙本質(zhì)磨片，掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）觀察；500 倍下每個(gè)磨片上選6 個(gè)視野，測骨吸收陷窩總數(shù)及總面積，取均值，作為該磨片吸收陷窩數(shù)目及面積；每組測3 個(gè)磨片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 定量數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 17.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析比較多組定量數(shù)據(jù)，LSD 法進(jìn)行多組內(nèi)兩兩比較；P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CaMKIIγ 干擾載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染效率測定本研究成功構(gòu)建了3 個(gè)CaMKIIγ RNA 干擾載體。用陰性載體轉(zhuǎn)染RAW264.7 細(xì)胞，綠色熒光蛋白（GFP）隨MOI 值增加表達(dá)增強(qiáng)。MOI 值為1、10、30、50 時(shí)，病毒轉(zhuǎn)染效率分別為4.0%、12.2%、80.9%、87.1%（圖1）；但MOI 值為50 時(shí)，部分細(xì)胞變形、崩解，故本實(shí)驗(yàn)確定病毒最佳MOI 值為30。

2.2 CaMKIIγ RNA 干擾效率測定

2.2.1 PCR 檢測mRNA 水平干擾效率 在qPCR儀上進(jìn)行CaMKIIγ 基因及管家基因β-actin 的PCR反應(yīng)，將對照組中第一個(gè)復(fù)孔的mRNA 表達(dá)量定義為1，則#1、#2、#3 干擾載體組相對于對照組的mRNA 水平分別為0.377 ± 0.031、0.477 ± 0.042 和0.230 ± 0.020，較對照組（1.100 ± 0.089）均顯著降低（P ＜0.01），分別下降了64.20%、54.61%和78.16%；而陰性載體組（1.053± 0.416）與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。上述結(jié)果提示，#3 干擾載體組mRNA 干擾效率最佳。

圖1 陰性載體轉(zhuǎn)染RAW264.7 細(xì)胞后最佳MOI 值確定（激光共聚焦顯微鏡，×200）Fig.1 Determination of optimal MOI value in RAW264.7 cells after transfection with negative vector（LSCM，×200）

2.2.2 Western blot 檢測CaMKIIγ 蛋白表達(dá)水平RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染5 d 后，蛋白質(zhì)印記檢測顯示，#1、#2、#3 干擾載體組CaMKIIγ 蛋白表達(dá)較對照組明顯降低（圖2）。定量分析表明，#1、#2、#3 干擾載體組蛋白表達(dá)光密度值與內(nèi)參β-actin 光密度值的比值分別為0.579 ± 0.104、0.404 ± 0.088和0.374 ± 0.108，較對照組（1.134 ± 0.141）分別下降了48.94%、64.37%和67.02%（P ＜0.01）；而陰性載體組與對照組（0.988 ± 0.073）無明顯差別（P ＞0.05）。上述結(jié)果說明，#1、#2、#3 干擾載體對CaMKIIγ 蛋白表達(dá)進(jìn)行了有效干擾，其中#3 干擾載體效果最佳。上述結(jié)果與mRNA 表達(dá)一致，因此選用#3 干擾載體用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 CaMKIIγ RNA 干擾對破骨細(xì)胞生成及骨吸收的影響 TRAP 染色陽性多核破骨細(xì)胞在3 組細(xì)胞中均出現(xiàn)；其中對照組和陰性載體組多核破骨細(xì)胞數(shù)較多，體積較大，而干擾載體組破骨細(xì)胞數(shù)目較少，體積較小（圖3）。定量分析表明（表1），干擾載體組破骨細(xì)胞數(shù)較對照組下降了59.99%（P ＜0.01）；而陰性載體組與對照組間差異無顯著性（P ＞0.05）。上述結(jié)果提示，CaMKIIγ RNA 干擾可顯著抑制破骨細(xì)胞生成。

圖2 蛋白質(zhì)印記法檢測5 組CaMKIIγ 蛋白表達(dá)Fig2 Detection of CaMKIIγ protein expression in five groups by Western-blot

SEM 顯示，3 組細(xì)胞均出現(xiàn)了不同數(shù)量的骨吸收陷窩，但干擾載體組較其他兩組骨吸收陷窩數(shù)目較少、面積較?。▓D3）。定量分析顯示（表1），干擾載體組骨吸收陷窩數(shù)目及面積較對照組分別下降了54.19%和57.94%（P ＜0.01）；而陰性載體組與對照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。上述結(jié)果表明，CaMKIIγ RNA 干擾可顯著抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能。

3 討論

原發(fā)性∕轉(zhuǎn)移性骨腫瘤、牙周炎、種植體周圍炎、骨質(zhì)疏松等疾病中的骨吸收均與破骨細(xì)胞分化與功能異常有關(guān)，因而破骨細(xì)胞分化調(diào)控研究是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。RANKL 作用于破骨細(xì)胞膜受體RANK 并募集胞內(nèi)TRAF（TNF receptor-associated factors），進(jìn)而通過Ca2+、NF-κB、MAPKs、Akt 等信號通路調(diào)控破骨細(xì)胞分化［6］。有研究已經(jīng)確定NF-κB 途徑是CaMKIIδ 和CaMKIIγ 下游激活的主要信號通路之一［7］。CaMKII、CaMKIV 均是胞內(nèi)Ca2+信號傳遞的關(guān)鍵分子［3，6］。PARK-MIN［8］及WILLIAM 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，RANKL 可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化早期CaMKII 磷酸化，提高其蛋白活性，提示其在破骨細(xì)胞分化中也可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖3 3 組破骨細(xì)胞生成（上排，TRAP 染色，×200）及牙本質(zhì)吸收陷窩（下排，SEM，×500）Fig.3 Detection of osteoclastogenesis（upper row，TRAP staining，×200）and absorption lacunaes on dentin slices（lower row，SEM，×500）in three groups

表1 破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)及牙本質(zhì)磨片吸收陷窩定量分析Tab.1 Quantitative analysis of osteoclast number and dentin resorption lacunaes（n=3） ±s

表1 破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)及牙本質(zhì)磨片吸收陷窩定量分析Tab.1 Quantitative analysis of osteoclast number and dentin resorption lacunaes（n=3） ±s

注：與對照組比較，aP ＜0.01

分組對照組陰性載體組干擾載體組F 值P 值破骨細(xì)胞數(shù)（個(gè)）26.670±1.528 23.330±2.517 10.670±1.528a 58.303＜0.01吸收陷窩數(shù)（個(gè)）16.000±1.000 13.670±1.528 7.330±1.528a 31.941＜0.01吸收陷窩面積（μm2）1 1701.000±361.805 1 1191.000±286.606 4 922.000±64.086a 590.703＜0.05

CaMKII 有α，β，γ 和δ 四個(gè)異構(gòu)體［10］。YAO等［4］研究發(fā)現(xiàn)，CaMKIIγ 在破骨細(xì)胞分化的第3、5天表達(dá)上升，而在分化結(jié)束時(shí)恢復(fù)正常，從而認(rèn)為其主要在破骨細(xì)胞分化早期階段發(fā)揮作用。而ANG 等［5］研究顯示，CaMKIIγ 在RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中一直穩(wěn)定高水平表達(dá)，而CaMKII 其他異構(gòu)體及CaMKIV 不表達(dá)或表達(dá)水平較低。CaMKIIγ 在破骨細(xì)胞分化中表達(dá)水平較高，且呈時(shí)間依賴性表達(dá)增強(qiáng)，其表達(dá)規(guī)律與CaMKIIδ 相似［7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CaMKIIδ RNA 干擾能夠使破骨細(xì)胞受到抑制，而且TRAP、NFATc1、c-Src（非受體酪氨酸激酶）等破骨細(xì)胞分化相關(guān)因子的基因表達(dá)下降；CaMKIIδ 過表達(dá)對破骨細(xì)胞分化和骨吸收無明顯影響［11］。破骨細(xì)胞是由分化的巨噬細(xì)胞形成的多核細(xì)胞，具有破骨功能。TIMMINS等［12］研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中的CaMKIIγ 活化可以引發(fā)細(xì)胞凋亡。上述研究均說明CaMKIIγ 在破骨細(xì)胞分化調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用；然而，其發(fā)揮的作用及可能的下游信號分子目前還知之甚少。

為了進(jìn)一步探索CaMKIIγ 在破骨細(xì)胞分化中的作用，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢病毒構(gòu)建CaMKIIγ RNA 干擾載體；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CaMKIIγ 基因沉默可顯著抑制破骨細(xì)胞生成及骨吸收功能，使破骨細(xì)胞數(shù)較對照組下降了59.99%，骨吸收陷窩數(shù)目和面積分別下降了54.19%和57.94%，提示CaMKIIγ 在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用；該研究結(jié)論與Ang等的研究相一致。ANG 等［5］應(yīng)用CaMKs 特殊抑制劑KN93、KN62 顯著抑制了RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成、骨吸收及Cathepsin K 表達(dá)；而應(yīng)用抑制劑KN92（對CaMKII 不起作用）則對破骨細(xì)胞生成無顯著影響；由于該研究同時(shí)證實(shí)在破骨細(xì)胞分化中CaMKIIγ 表達(dá)較高，而CaMKII 其 他 異構(gòu)體及CaMKIV 不表達(dá)或表達(dá)水平較低，因而支持本研究CaMKIIγ 在破骨細(xì)胞分化中起關(guān)鍵調(diào)控作用的結(jié)論。

有關(guān)CaMKII 對破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的機(jī)制，目前還知之甚少，可能與MAPK、CREB、Akt 等信號分子有關(guān)。

MAPK 家族包括信號分子ERK、JNK 和P38。ERK 的磷酸化對破骨細(xì)胞存活非常重要［13］；同時(shí)ERK 的持續(xù)活性可誘導(dǎo)integrinαvβ3 表達(dá)從而在破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞融合階段發(fā)揮作用［14］。YAO等應(yīng)用CaMKs 抑制劑KN93 處理骨髓單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其顯著抑制早期RANK 下游信號分子中ERK 和Akt 蛋白活化［15］；認(rèn)為CaMKII 可能通過調(diào)節(jié)ERK和Akt 影響破骨細(xì)胞早期分化［4］。ANG 等［5］研究顯示，CaMKs 抑制劑KN93 和KN62 可顯著抑制破骨細(xì)胞內(nèi)RANKL 誘發(fā)的CREB 轉(zhuǎn)錄活性及ERK 磷酸化，提示二者在CaMKII（γ）介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于MAPK 是RANK 下游信號分子，因而CaMKII 通過ERK 與RANK 間存在信號相互作用。PARK-MIN 等［8］也提出，在MEKERK 信號傳導(dǎo)途徑中RANK 和CaMKII 之間存在交叉。我們前期研究發(fā)現(xiàn)［16］，CaMKIIδ 基因沉默可顯著抑制破骨細(xì)胞生成及骨吸收，并下調(diào)CREB、ERK、JNK、P38 蛋白磷酸化水平；而ERK、JNK、P38特異抑制劑對破骨細(xì)胞分化產(chǎn)生相似的抑制作用，從而說明這些信號分子參與了CaMKIIδ 對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控，同樣說明CaMKII 和RANK 之間存在信號交叉。在神經(jīng)細(xì)胞中CaMKIIγ 將Ca2+∕鈣調(diào)蛋白從神經(jīng)元表面轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，使CREB 磷酸化和基因表達(dá)［17］。前面提到CaMKIIγ 表達(dá)規(guī)律與CaMKIIδ 相似，是否CREB、ERK、JNK 等信號分子參與CaMKIIγ 對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控，其調(diào)控的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究成功構(gòu)建了CaMKIIγ 慢病毒干擾載體，并證實(shí)CaMKIIγ 可顯著抑制破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能，提示CaMKIIγ 在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，為后期CaMKIIγ 的相關(guān)信號分子機(jī)制研究及臨床治療骨吸收性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。