馮 凱，華 沛，顧 瓊，何 琳，滕希峰*，曾令杰*

1廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院 國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室；2中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006；3廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院 廣東省化妝品技術(shù)研究中心，中山 528458

大葉土蜜樹(Brideliaretusa)屬于大戟科(Euphorbiaceae)土蜜樹屬(Bridelia)植物，別名蝦公木、華南逼迫子，廣泛分布于湖南、廣東、海南、貴州和云南等省區(qū)[1]。大葉土蜜樹作為藥用植物在印度民間廣泛用于治療風(fēng)濕、痢疾、腹瀉等其他疾病[2,3]。據(jù)報道，其莖粗提物具有止痛、抗炎和抗菌等活性[4,5]。前期對于大葉土蜜樹莖部分的化學(xué)成分研究報道較少，主要成分為三萜、倍半萜、黃酮以及酚類成分[2,5,6]。為了更加深入研究其物質(zhì)基礎(chǔ)并找到可能的抗炎活性成分，我們對產(chǎn)于云南的大葉土蜜樹的莖部分進行了系統(tǒng)化學(xué)成分研究，從中提取分離到了11個化合物，分別鑒定為沒食子酸(1)，木栓酮(2)，阿魏酸二十七烷脂(3)，芥子醛(4)，丁香醛(5)，丁香脂素(6)，補骨脂內(nèi)脂(7)，補骨脂酚(8)，二十五烷酸(9)，亞油酸(10)，1-Linoleoylglycerol(11)?；衔?～11為首次從土蜜樹屬中分離得到。同時測定化合物1～11對LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞NO生成抑制活性。其中化合物4、5、10和11顯示出較強的抗神經(jīng)炎作用，其IC50分別為12.57、8.41、5.86、5.86 μM。

1 材料與儀器

LC-MS液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；1H NMR,13C NMR用Bruker Advance 500型或400型超導(dǎo)核磁共振儀(德國Bruker公司)測定，溶劑為CDCl3、CD3OD；柱層析填料：正相硅膠(200～300目，青島海洋化工有限公司)，反相填充材料RP-18(40～75μm，Biotage公司)，Sephadex LH-20(瑞典GE healthcare)；GF254薄層層析正相硅膠板(青島海洋化工有限公司)；顯色劑為10%的硫酸乙醇溶液。

大葉土蜜樹(B.retusa)莖部分于2015年9月采集于云南臨滄，由中國科學(xué)院昆明植物研究所韓春艷博士鑒定，標(biāo)本存放于中山大學(xué)藥學(xué)院藥物設(shè)計中心。

2 提取和分離

將大葉土蜜樹(B.retusa)莖部分，8.4 kg，粉碎后稱重，用95%乙醇在室溫下浸泡提取4次，每次三天。過濾回收提取液并減壓濃縮得粗提物400 g。粗提物用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液減壓濃縮得到乙酸乙酯部分浸膏168 g。

將乙酸乙酯層浸膏用等量正相硅膠(200～300目，青島海洋化工)拌樣，經(jīng)硅膠柱色譜，用三氯甲烷/甲醇進行梯度系統(tǒng)(v/v，1∶0→0∶1)得到6個組分Fr.A-F。Fr.B(1.6 g)經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚/乙酸乙酯(v/v， 99∶1→80∶20)梯度洗脫得到亞組份Fr.B1-B7。Fr.B6(235 mg)經(jīng)制備薄層得到化合物3(107 mg)，F(xiàn)r.B5(58 mg)經(jīng)薄層制備得到化合物6(22 mg)。Fr.C(34 g)經(jīng)反相色譜柱(RP-C18)，用甲醇/水(v/v，30%→100%)梯度洗脫得到亞組分Fr.C1-C4。流分Fr.C1(10 g)經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚/乙酸乙酯(v/v，7∶3→1∶1)梯度洗脫得到亞組分Fr.C1.1-Fr.C1.5。Fr.C1.3(864 mg)經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脫，得到Fr.C1.3.1-Fr.C1.3.3。Fr.C1.3.2(643 mg)經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷/乙酸乙酯(v/v，95∶5→80∶20)梯度洗脫得到化合物4(4.7 mg)和5(3.9 mg)。Fr.C1.5(4.5 g)經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脫，得到Fr.C1.5.1-Fr.C1.5.5和化合物1(1.42 g)。Fr.C2(7 g)經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚/乙酸乙酯(v/v，9∶1→1∶1)梯度洗脫得到化合物7(4 mg)。Fr.C3(4.4 g)經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚/乙酸乙酯(v/v， 95∶5→1∶1)梯度洗脫和制備型HPLC得到化合物8(25 mg)、10(10 mg)和11(9 mg)。Fr.C4(3 g)經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚/乙酸乙酯(v/v，95∶5→6∶4)梯度洗脫和重結(jié)晶得到化合物2(12 mg)和9(18 mg)。

圖1 化合物1～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-11

3 波譜數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色固體(MeOH);分子式為C7H6O5，ESI-MS:m/z169.1 [M-H]-;1H NMR (400 Hz,CD3OD)δ:7.01 (2H,s,H-2,H-6);13C NMR (100 Hz,CD3OD)δ:169.7 (C-7),145.7 (C-3,C-5),138.9 (C-4),121.3 (C-1),109.7 (C-2,C-6)。以上數(shù)據(jù)和文獻[7]對照基本一致，故確定化合物為沒食子酸。

化合物2無色針狀結(jié)晶;分子式為C30H50O，EI-MS:m/z426 [M]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:1.18 (3H,s,H-28),1.05 (3H,s,H-27),1.00 (6H,s,H-26,H-30),0.95 (3H,s,H-29),0.88 (3H,d,J=7.0 Hz,H-23),0.87 (3H,s,H-25),0.72 (3H,s,H-24);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:213.5 (C-3),59.7 (C-10),58.5 (C-4),53.3 (C-8),43.0 (C-18),42.4 (C-5),41.8 (C-2),41.5 (C-6),39.9 (C-13),39.5 (C-22),38.5 (C-14),37.7 (C-9),36.2 (C-16),35.9 (C-11),35.6 (C-19),35.3 (C-29),33.0 (C-21),32.6 (C-15),32.3 (C-28),32.0 (C-30),30.7 (C-12),30.2 (C-17),28.4 (C-20),22.5 (C-1),20.5 (C-26),18.9 (C-27),18.5 (C-7),18.2 (C-25),14.9 (C-24),7.1 (C-23)。以上數(shù)據(jù)和文獻[8]對照基本一致，故確定化合物為木栓酮。

化合物3白色粉末;分子式為C37H64O4，EI-MS:m/z572 [M]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:7.61 (1H,d,J=15.9 Hz,H-7),7.06 (1H,d,J=8.1 Hz,H-6),7.02 (1H,brs,H-2),6.91 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.29 (1H,d,J=15.9 Hz,H-8),6.01 (1H,s,OH),4.19 (2H,t,J=6.7 Hz,H-1′),3.91 (3H,s,OCH3),1.69 (2H,m,H-2′),1.38 (48H,m,H-3′～26′),0.86 (3H,t,J=6.7 Hz,H-27′);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:167.6 (C-9),148.2(C-4),147.0(C-3),144.8(C-7),127.2(C-1),123.2(C-6),115.8(C-5),114.9(C-8),109.6(C-2),64.8(C-1′),56.1(3-OCH3),26.2～32.1(C-3′～C-26′),22.9(C-2′),14.3(C-27′)。以上數(shù)據(jù)和文獻[9]對照基本一致，故確定化合物為阿魏酸二十七烷脂。

化合物4黃色粉末;分子式為C11H12O4，ESI-MS:m/z209.1 [M+H]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:9.66 (1H,d,J=7.7 Hz,d,H-9),7.37 (1H,d,J=15.8 Hz,H-7),6.82 (1H,s,H-2,H-6),6.61 (1H,dd,J=15.8,7.7 Hz,H-8),3.94 (6H,s,2×OCH3);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:193.7(C-9),153.4(C-7),147.5(C-3,C-5),138.2(C-4),127.0(C-8),125.8(C-1),105.7(C-2,C-6),56.6(OCH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻[10]對照基本一致，故確定化合物為芥子醛。

化合物5淡黃色粉末;分子式為C9H10O4，ESI-MS:m/z183.1 [M+H]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:9.82 (1H,s,H-7),7.15 (2H,s,H-3,H-6),3.95 (6H,s,2×OCH3);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:190.9(C-7),147.5(C-3,C-5),141.0(C-4),128.6(C-1),106.9(C-2,C-6),56.6(2×OCH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻[11]對照基本一致，故確定化合物為丁香醛。

化合物7白色針狀結(jié)晶;分子式為C11H6O3，ESI-MS:m/z187.1 [M+H]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:7.80 (1H,d,J=9.6 Hz,H-4),7.70 (1H,d,J=2.3 Hz,H-2′),7.69 (1H,s,H-5),7.48 (1H,s,H-8),6.83 (1H,dd,J=2.3,1.0 Hz,H-3′),6.38 (1H,d,J=9.6 Hz,H-3);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:161.3(C-2),156.6(C-7),152.3(C-9),147.1(C-2′),144.3(C-4),125.1(C-6),120.0(C-5),115.6(C-10),114.9(C-3),106.6(C-3′),100.1(C-8)。以上數(shù)據(jù)和文獻[13]對照基本一致，故確定化合物為補骨脂素。

化合物8淺黃色油狀;分子式為C18H24O，ESI-MS:m/z271.2 [M+H]+;1H NMR (400 Hz,CDCl3)δ:7.25 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2,H-6),6.77 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,H-5),6.25 (1H,d,J=16.0 Hz,H-7),6.05 (1H,d,J=16.0 Hz,H-8),5.88 (1H,dd,J=17.4,10.7 Hz,H-17),5.11 (1H,t,J=7.3 Hz,H-12),5.02 (2H,m,H-18),1.95 (2H,m,H-10),1.67 (3H,s,H-14),1.58 (3H,s,H-15),1.45 (2H,m,H-11),1.19 (3H,s,H-16);13C NMR (100 Hz,CDCl3)δ:154.9 (C-4),146.2 (C-17),136.0 (C-7),131.5 (C-1),131.0 (C-13),127.6 (C-2,C-6),126.7 (C-8),125.0 (C-12),115.6 (C-3,C-5),112.1 (C-18),42.7 (C-9),41.5 (C-10),25.9 (C-15),23.6 (C-16),23.4 (C-11),17.9 (C-14)。以上數(shù)據(jù)和文獻[14]對照基本一致，故確定化合物為補骨脂酚。

化合物9白色粉末;分子式為C25H50O2，EI-MS :m/z382 [M]+;1H NMR (400 Hz,CDCl3)δ:2.28 (2H,t,J=7.5 Hz,H-2),1.56 (2H,m,H-3),1.20～1.30 (42H,m,21×CH2),0.88 (3H,t,J=6.6 Hz,H-25);13C NMR (100 Hz,CDCl3)δ:178.8 (-COOH),14.1(-CH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻[15]對照基本一致，故確定化合物為二十五烷酸。

化合物10無色油狀;分子式為C18H32O2，EI-MS:m/z280 [M]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:5.35 (4H,m,H-9,H-10,H-12,H-13),2.77 (2H,t,J=6.7 Hz,H-11),2.34 (2H,t,J=7.5 Hz,H-2),2.05 (4H,q,J=7.0 Hz,H-8,H-14),1.63 (2H,m,H-3),1.25 (14H,m,H-4～7,H-15～17),0.82 (3H,t,J=6.7 Hz,H-18);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:180.3(C-1),130.4(C-13),130.2(C-9),128.2(C-12),128.0(C-10),34.3(C-2),31.7(C-16),29.7(C-7),29.5(C-15),29.3(C-6),29.2(C-5),29.2(C-4),27.4(C-8),27.3(C-14),25.8(C-11),24.8(C-3),22.7(C-17),14.2(C-18)。以上數(shù)據(jù)和文獻[16]對照基本一致，故確定化合物為亞油酸。

化合物11無色油狀;分子式為C21H38O4，EI-MS:m/z354 [M]+;1H NMR (400 Hz,CDCl3)δ:5.35 (4H,m,H-9,H-10,H-12,H-13),4.20 (1H,dd,J=11.7,4.7 Hz,Ha-19),4.14 (1H,dd,J=11.7,6.1 Hz,Hb-19),3.92 (1H,m,H-20),3.69 (1H,dd,J=11.5,3.9 Hz,Ha-21),3.59 (1H,dd,J=11.5,5.8 Hz,Hb-21),2.76 (2H,t,J=6.4 Hz,H-11),2.35 (2H,t,J=7.6 Hz,H-2),2.04 (4H,q,J=6.8 Hz,H-8,H-14),1.62 (2H,m,H-3),1.31 (14H,m,H-4～7,H-15～17),0.88 (3H,t,J=6.7 Hz,H-18);13C NMR (100 Hz,CDCl3)δ:174.6(C-1),130.4(C-9),130.2(C-13),128.3(C-10),128.1(C-12),70.5(C-20),65.4(C-19),63.5(C-21),34.3(C-2),31.3(C-16),29.8(C-7),29.6(C-6),29.4(C-15),29.3 (C-5),29.3(C-4),27.4(C-8),27.4(C-14),25.8(C-11),25.1(C-3),22.8(C-17),14.3(C-18)。以上數(shù)據(jù)和文獻[17]對照基本一致，故確定化合物為1-Linoleoylglycerol。

4 化合物的抗神經(jīng)炎癥活性篩選

采用LPS誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2細(xì)胞，評價11個化合物的抗神經(jīng)炎癥活性。

用Griess試劑檢測LPS刺激的BV-2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中的NO水平。將處于對數(shù)生長期的BV-2細(xì)胞按4×105個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，細(xì)胞培養(yǎng)48 h之后，吸除舊培養(yǎng)基，加入80 μL DMEM。30 min后，加入10 μL待測化合物預(yù)處理30 min，最后加入10 μL LPS ( 1 μg/mL ) 誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥?；衔镒饔?4 h，吸取50 μL細(xì)胞上清液于新的96孔板中，依次加入50 μL Griess試劑Ⅰ、試劑Ⅱ。用多功能酶標(biāo)儀工作站檢測其在540 nm處的吸收強度。

活性測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物4、5、10和11具有較強的抑制NO生成活性，其IC50值分別為12.57、8.41、5.86、5.86 μM。

5 結(jié)論

本研究從大葉土蜜樹(B.retusa)莖部分的醇提物中分離鑒定了11個化合物，其中，化合物3～11為首次從土蜜樹屬中分離得到。對分離到的11個化合物進行抗神經(jīng)炎活性研究，其中酚酸類化合物4、5、10和11有較強的抗神經(jīng)炎活性。據(jù)文獻[18]報道，化合物5對腦缺血損傷的大鼠具有一定的神經(jīng)保護作用?；衔?、10、11為首次報道具有抗神經(jīng)炎活性，這為酚酸類化合物的藥物開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。