梁艷，倪煒，王夢琦，儲雙鳳，楊章平，毛永江

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

乳蛋白約占乳中干物質(zhì)的90%，是乳中重要的營養(yǎng)物質(zhì)和主要的含氮物質(zhì)，主要包括乳清蛋白和酪蛋白兩大類。乳清蛋白包括α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、血清蛋白和少量免疫球蛋白，其中β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分。酪蛋白是乳中含量最高的蛋白質(zhì)，包括αs1-酪蛋白（αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）。Ashaffenburg等[1]研究證明β-乳球蛋白基因存在多態(tài)性，其多態(tài)性與泌乳性能、乳成分等方面的相關(guān)性引起人們的廣泛關(guān)注，其后關(guān)于β-酪蛋白（β-CN）基因的多態(tài)性也有相繼報道[2,3]。其中，β-乳球蛋白是反芻動物乳中主要乳清蛋白組分，占總?cè)槊拥?0%～60%。研究已確定編碼牛乳中β-乳球蛋白的基因主要存在A、B兩種等位基因，不同等位基因?qū)Ξa(chǎn)奶量和乳成分有不同的影響[4]。β-酪蛋白占總?cè)榈鞍椎?0%，是人體氨基酸的重要來源，并能促進(jìn)礦物質(zhì)在人體內(nèi)的消化及吸收，在一定程度上反映泌乳能力[5]，能夠作為有效評估牛乳品質(zhì)的指標(biāo)之一[6]。近年來國內(nèi)外對于乳蛋白基因多態(tài)性進(jìn)行過多次報道，對不同乳蛋白基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)做了相關(guān)性研究[7～10]。研究表明，乳蛋白基因多態(tài)性與泌乳性能之間存在一定的關(guān)聯(lián)。

近年來我國奶業(yè)發(fā)展迅速，除從新西蘭、澳大利亞進(jìn)口奶牛以外，2015年開始從智利引進(jìn)。據(jù)不完全統(tǒng)計，2015年我國從智利進(jìn)口奶牛共計22 817頭，北京、山東、江蘇等地均引進(jìn)大批智利荷斯坦牛，占進(jìn)口奶?？倲?shù)的14.89%[11]。2017年從智利進(jìn)口9 628頭，占全部進(jìn)口奶?？倲?shù)的12.1%。江蘇某大型奶牛場于2015年從智利引進(jìn)荷斯坦牛6 000頭，目前大部分已處于第二胎，具有完整的生產(chǎn)性能記錄。本研究旨在利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析智利進(jìn)口荷斯坦牛β-Lg和β-CN的基因多態(tài)性，同時探索其多態(tài)性對泌乳性能的影響，為標(biāo)記輔助育種、提高智利進(jìn)口荷斯坦牛的泌乳性能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 乳樣采集及乳蛋白的分離

2017年10月于江蘇某大型奶牛場隨機(jī)選擇健康的智利進(jìn)口荷斯坦牛286頭。在進(jìn)行DHI檢測采樣時，每頭牛采取混合均勻的奶樣5mL，置于冰瓶保存并迅速帶回實驗室。室溫下奶樣解凍，4 000r/min離心10min，取出下層脫脂乳，其中1mL用于保存，剩余4mL奶樣加入0.2mol/L乙酸和0.2mol/L乙酸鈉各0.15mL，調(diào)pH值至4.6。4 000r/min離心8min，吸上層乳清于-40℃保存?zhèn)溆?。下層酪蛋白沉淀用醋酸緩沖液（pH4.6）洗滌兩次，每次4 000r/min離心8～10min，凍干于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 樣品處理

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測樣品β-Lg和β-CN基因的多態(tài)性，并用快速染色法進(jìn)行染色，7%冰醋酸中保存[10]。

1．3 數(shù)據(jù)收集與整理

數(shù)據(jù)來自該采樣牛場2016～2018年1～2胎采樣牛只的DHI記錄，主要包括牛號、采樣時間、胎次、產(chǎn)犢日期、泌乳天數(shù)、日產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、體細(xì)胞數(shù)、體細(xì)胞評分、尿素氮含量等信息。為保證結(jié)果的可靠性，數(shù)據(jù)不完整的記錄不納入分析，同時對DHI測定日記錄進(jìn)行了限定：泌乳時間為產(chǎn)后第5～365天，測定日產(chǎn)奶量為5～60kg，乳脂率為2%～7%，乳蛋白率為2%～6%，體細(xì)胞評分為0～9。經(jīng)篩選，測定日記錄數(shù)從原來的4 596條減少到最后3 185條。

1．4 統(tǒng)計分析

1.4.1 群體遺傳分析

用SHEsis軟件構(gòu)建乳蛋白基因型單倍型，使用r2的方法進(jìn)行連鎖不平衡分析，其取值范圍從0（連鎖平衡）到1（完全連鎖不平衡）。并用POPGEN（3.2）進(jìn)行群體遺傳統(tǒng)計分析，進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗，并計算基因頻率和基因型頻率、平均雜合度He和平均有效等位基因數(shù)Ne。

1.4.2 最小二乘模型

該模型為有一定固定效應(yīng)且各因素間無互作的線性模型，模型如下：

式中，Yijklmno為泌乳性狀的觀察值；μ為總體均值；Yi為采樣年度的固定效應(yīng)；Sj為采樣季節(jié)的固定效應(yīng)；CSk為產(chǎn)犢季節(jié)的固定效應(yīng)；Ll為泌乳階段的固定效應(yīng)；β-Lgm為β-Lg基因型的固定效應(yīng)；β-CNn為β-CN基因型的固定效應(yīng)；eijklmno為隨機(jī)剩余效應(yīng)。

在奶牛一個泌乳周期中，按泌乳時間可劃分為4個階段，產(chǎn)后5～100d為泌乳前期，產(chǎn)后101～200d為泌乳中期，產(chǎn)后201～305d為泌乳后期，產(chǎn)后306～365d為泌乳末期。按照當(dāng)?shù)貧夂蛱攸c(diǎn)，季節(jié)劃分如下：春季為3～5月，夏季為6～8月，秋季為9～11月，冬季為12月到翌年2月。

所有數(shù)據(jù)用Excel錄入，并用SPSS（Ver16.0）分析乳蛋白基因座對奶牛泌乳性能的影響。相同因素不同水平間多重比較采用Duncan’s法。

2 結(jié)果與分析

2．1 β-Lg和β-CN基因頻率、基因型頻率及遺傳變異分析

智利進(jìn)口荷斯坦牛β-Lg和β-CN基因型頻率和基因頻率值見表1。根據(jù)SHEsis軟件分析可知，β-Lg和β-CN基因均呈多態(tài)性，其中β-Lg有A、B兩種等位基因，基因頻率分別為0.477和0.523，有AA、BB、AB三種基因型，優(yōu)勢基因型為AB型，頻率為0.569。β-Lg基因平均雜合度（He）為0.496，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.994。經(jīng)χ2檢驗β-Lg基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。

β-CN有A、B兩種等位基因，基因頻率分別為0.960和0.040，有AA和AB兩種基因型，優(yōu)勢基因型為AA型，頻率為0.920。β-CN基因平均雜合度（He）為0.077，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.083。經(jīng)χ2檢驗β-CN基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。

β-Lg和β-CN多態(tài)基因座可構(gòu)成4種單倍型（表2）。其中單倍型AA和BA的個體數(shù)最多，頻率分別為0.520和0.457。AB和BB個體最少，頻率分別為0.024和0.016。連鎖分析表明：β-Lg和β-CN之間連鎖不平衡系數(shù)為0.001，系數(shù)趨近于0，說明均處于連鎖平衡狀態(tài)。

表1 β-Lg和β-CN的基因型頻率、基因頻率及遺傳變異分析

表2 β-Lg和β-CN基因兩個位點(diǎn)的單倍型分析

2．2 β-Lg和β-CN多態(tài)性對智利進(jìn)口荷斯坦牛泌乳性能的影響

用最小二乘模型分析各因素對荷斯坦牛泌乳性能的影響，結(jié)果由表3可知，β-Lg對日產(chǎn)奶量、乳蛋白率和SCS有極顯著影響（P＜0.01），對乳脂率、脂蛋白比、相鄰二次日產(chǎn)奶量差和相鄰二次體細(xì)胞評分差影響不顯著（P＞0.05）。多重比較分析表明：AB型個體日產(chǎn)奶量極顯著高于AA、BB型（P＜0.01）；BB型個體的尿素氮含量極顯著高于AA、AB型（P＜0.01）；AA、AB型個體的蛋白率和SCS極顯著高于BB型（P＜0.01）。

β-CN對乳蛋白率和脂蛋白比有顯著影響（P＜0.05）；對日產(chǎn)奶量有極顯著影響（P＜0.01）；對乳脂率、SCS、尿素氮含量、相鄰二次日產(chǎn)奶量差和相鄰二次體細(xì)胞評分差影響不顯著（P＞0.05）。多重分析表明：AB型個體的日產(chǎn)奶量極顯著高于AA型（P＜0.01），脂蛋白比顯著高于AA型（P＜0.05）；AA型個體的乳蛋白率顯著高于AB型（P＜0.05）。

由表4可知，在非遺傳因素方面，采樣年度對日產(chǎn)奶量、SCS、尿素氮含量和相鄰二次日產(chǎn)奶量差影響極顯著（P＜0.01），對乳蛋白率和脂蛋白比影響顯著（P＜0.05）；采樣季節(jié)對日產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、SCS、尿素氮含量和相鄰二次日產(chǎn)奶量差影響極顯著（P＜0.01）；產(chǎn)犢季節(jié)對日產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率和脂蛋白比影響極顯著（P＜0.01），對SCS影響顯著（P＜0.05）；泌乳階段對日產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、SCS、尿素氮含量和相鄰二次日產(chǎn)奶量差有極顯著的影響（P＜0.01），對相鄰二次體細(xì)胞評分差有顯著影響（P＜0.05）；胎次對日產(chǎn)奶量影響極顯著（P＜0.01），對相鄰二次日產(chǎn)奶量差影響顯著（P＜0.05）。

3 討論

有研究表明，在不同牛品種間以及同一品種內(nèi)不同地區(qū)群體間牛乳蛋白多態(tài)性存在一定的差異，如β-CN的B等位基因在麥洼牦牛中的基因頻率為1.000，表現(xiàn)為單態(tài)[12]；κ-CN的B等位基因在娟姍牛中頻率顯著高于在荷斯坦牛中頻率[13]。此外，Eenennaam等[13]對美國加州不同品種奶牛乳蛋白多態(tài)性的研究表明，娟姍牛β-Lg和β-CN的A基因頻率分別為0.37和0.67，而荷斯坦牛相應(yīng)的基因頻率分別為0.43和0.98。陳宏宇等[7]的研究結(jié)果表明，β-Lg由A、B兩種等位基因控制，基因頻率均為0.5000；β-CN的A為優(yōu)勢等位基因，基因頻率為0.9667。Auldist等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，β-Lg的AA基因型控制表達(dá)的乳球蛋白比BB基因型表達(dá)的乳球蛋白高?？梢?，在不同地區(qū)以及不同品種間的牛乳蛋白基因頻率分布存在差異，然而荷斯坦牛β-Lg的B等位基因頻率在0.45～0.65之間，β-CN的A等位基因頻率高于0.95，趨于固定。

表3 β-Lg和β-CN基因多態(tài)性對智利進(jìn)口荷斯坦牛泌乳性能的影響

表4 利用最小二乘模型對智利進(jìn)口荷斯坦牛泌乳性能進(jìn)行方差分析的F值

本研究表明，β-Lg和β-CN基因多態(tài)性對日產(chǎn)奶量和乳成分含量有顯著影響，與邢世宇等[10]、羅軍等[15]、郭彥斌等[16]報道的結(jié)果一致。Dario研究發(fā)現(xiàn)β-Lg基因的多態(tài)性與乳蛋白率有密切關(guān)系[17]，影響牛乳產(chǎn)量和蛋白質(zhì)含量[18]，這一點(diǎn)與本研究一致。研究結(jié)果進(jìn)一步表明，β-Lg和β-CN對于日產(chǎn)奶量的影響極顯著，其中β-Lg的AA基因型為影響日產(chǎn)奶量的優(yōu)勢基因型，而邢世宇等[10]指出澳系荷斯坦牛β-Lg的AB基因型為影響日產(chǎn)奶量的優(yōu)勢基因型，造成這些差異的原因可能是不同遺傳背景下β-Lg基因座的遺傳效應(yīng)不一致。羅軍等[15]研究表明β-CN對乳脂率有顯著影響，郭彥斌等[16]研究表明β-CN對乳脂率、乳蛋白率均有顯著影響，而本研究表明β-CN對乳蛋白率的影響顯著，對乳脂率的影響不顯著。造成這些不一致的原因可能是乳蛋白各遺傳座位基因間的組合效應(yīng)，如β-Lg基因通過與酪蛋白基因組合或相互作用，從而影響乳蛋白的含量[19]。邢世宇等[10]的研究表明β-Lg對SCS、尿素氮含量的影響不顯著，而本研究結(jié)果表明β-Lg對SCS、尿素氮含量的影響極顯著，造成這些差異的原因可能是不同環(huán)境中乳蛋白基因座對泌乳性狀的影響不一致。本研究對β-Lg、β-CN對相鄰二次日產(chǎn)量差和相鄰二次體細(xì)胞評分差的影響也進(jìn)行了研究，結(jié)果均為不顯著。相鄰二次日產(chǎn)奶量差和相鄰二次體細(xì)胞評分差分別反映奶牛泌乳持續(xù)能力和體細(xì)胞數(shù)的變化情況，在奶業(yè)生產(chǎn)中有重要意義，但這方面的研究國內(nèi)外均較少。影響奶牛泌乳性能的因素較多，如采樣年度、采樣季節(jié)、產(chǎn)犢季節(jié)、泌乳階段和胎次等非遺傳因素[20]，其對泌乳性能的影響也較大，這就要求在實踐生產(chǎn)中不僅要重視遺傳因素，也要重視非遺傳因素對生產(chǎn)性狀的影響。

4 結(jié)論

從本研究結(jié)果可知，智利進(jìn)口荷斯坦牛β-Lg有A、B兩種等位基因，有AA、AB、BB三種基因型，對日產(chǎn)奶量、乳蛋白率、SCS和尿素氮含量均有極顯著影響；β-CN有A、B兩種等位基因，有AA和AB兩種基因型，對乳蛋白率和脂蛋白比有顯著影響，對日產(chǎn)奶量影響極顯著。該結(jié)果為智利進(jìn)口荷斯坦牛早期選擇和泌乳性能的提高提供了參考依據(jù)。