孫會(huì)會(huì) 袁明俊 胡 琨 仲建軍

（德州市公安局物證鑒定研究中心 山東 德州 253000）

1 引言

右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）分子式是C13H16N2，分子量為200.2795，CAS號(hào)是113775-47-6，是美托咪定的右旋異構(gòu)體。這種藥物是一種選擇性和特異性較強(qiáng)的α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，能夠緩解疼痛、焦慮，具有一定的催眠藥效作用[1-2]。該藥物能夠使血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，對(duì)于認(rèn)知功能及呼吸產(chǎn)生副作用較小，主要應(yīng)用于重癥加強(qiáng)護(hù)理病房?jī)?nèi)患者插管及采用呼吸機(jī)時(shí)患者的鎮(zhèn)靜。由于這種藥物麻醉效果起效快，有些不法分子利用該藥物使受害人失去意識(shí)，對(duì)其實(shí)施強(qiáng)奸等違法犯罪行為，當(dāng)前，此類案件呈現(xiàn)多發(fā)態(tài)勢(shì)，建立一種血液中該藥物濃度的快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法顯得尤為重要。

對(duì)于右美托咪定的檢驗(yàn)方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）[3-4]、高效液相色譜法（HPLC）[5-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（L C-M S）[7-8]。國(guó)內(nèi)對(duì)于該藥物在血液中濃度測(cè)定的相關(guān)報(bào)道比較少，本文在此基礎(chǔ)上，利用乙腈沉淀蛋白法對(duì)血液檢材進(jìn)行前處理，采用Shimadzu公司的LC-20 AD超快速液相色譜儀結(jié)合ABSciex 3200 Q Trap三重四級(jí)桿-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀，選取多反應(yīng)檢測(cè)模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）進(jìn)行信號(hào)采集，對(duì)血液中右美托咪定成分進(jìn)行定性，外標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)該藥物在血液中的濃度進(jìn)行定量分析。該方法前處理操作步驟簡(jiǎn)單且用時(shí)短，具有良好的重現(xiàn)性、較好的回收率和高靈敏度，適合人體血液中右美托咪定成分的臨床毒物分析檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器設(shè)備

Shimadzu Prominenece UFLC (LC-20AD泵) -ABSciex 3200 Q Trap；BSA-323S型電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，中國(guó)）；移液器（德州艾本德股份有限公司，中國(guó)）；VORTEXGENIE2渦輪振蕩器（Scientific Industries公司，美國(guó)）；TGL-16C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，中國(guó)）。

2.2 試劑

右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.9 %，中國(guó)科學(xué)院成都科學(xué)研究所，中國(guó)）；甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）；甲醇、乙腈（色譜純，M e r c k公司，德國(guó)）。

2.3 右美托咪定儲(chǔ)備液的配置

用用電子天平精確稱量10.0mg的標(biāo)準(zhǔn)品于10mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，配置濃度為1mg/mL的右美托咪定儲(chǔ)備液，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)中，不同濃度的右美托咪定溶液通過(guò)用甲醇稀釋該儲(chǔ)備液得到。

2.4 樣品前處理

取0.5 mL血液樣本于5 mL試管中，按血液和乙腈體積比1:3加入1.5 mL沉淀劑乙腈，用振蕩器進(jìn)行振蕩混勻，以轉(zhuǎn)速8000 r/min離心10 min，取出上層清液，通過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，將濾液置于進(jìn)樣瓶中，供UFLC-MS/MS分析。

2.5 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse C18（4.6 mm×150mm, 5.0μm）作為液相色譜柱，柱溫設(shè)定40℃，進(jìn)樣量設(shè)定1μL，流動(dòng)相組成是去離子水+0.1%甲酸（A相）-乙腈（B相），流速設(shè)定1.2mL/min，采用梯度洗脫程序：0~1.00min有機(jī)相B設(shè)20%，1.00~3.50min有機(jī)相B以30%/min從濃度20%升到95%，3.50~4.00min有機(jī)相B以濃度95%保持0.50min，4.10min有機(jī)相B降到20%并保持到6min，梯度洗脫程序結(jié)束。

質(zhì)譜條件：選擇電噴霧電離，以正離子模式，利用多反應(yīng)檢測(cè)模式為檢測(cè)手段，離子化電壓：+5500 V，碰撞氣：Medium；氣簾氣：35 psi；噴霧氣：65 psi；輔助加熱氣：65 psi；離子源溫度：650℃；接口加熱：On。經(jīng)優(yōu)化后，右美托咪定的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 右美托咪定的質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

色譜條件：實(shí)驗(yàn)中將甲醇、乙腈作為有機(jī)相進(jìn)行分離效果的考察，結(jié)果表明在相同的色譜柱，相同的梯度洗脫程序下，乙腈作為有機(jī)相時(shí)，右美托咪定在色譜柱上的分離效果較為理想，峰形良好。在樣品前處理過(guò)程中，選取乙腈作為蛋白沉淀劑，所以實(shí)驗(yàn)中有機(jī)相B選擇乙腈。

本文分別考察了去離子水-乙腈和去離子水+0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相對(duì)右美托咪定的梯度洗脫效果，結(jié)果顯示在相同的條件下，去離子水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，右美托咪定的出峰時(shí)間拖后，分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且保留時(shí)間不穩(wěn)定，峰寬較寬且有拖尾現(xiàn)象；選擇去離子水+0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，峰形有所改善，分離效果好，峰寬較窄。

實(shí)驗(yàn)選取去離子水+0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相，設(shè)定B相起始濃度20%，比較3個(gè)不同的梯度陡度：10%、20%和30%，進(jìn)行梯度洗脫時(shí)的洗脫效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，當(dāng)B相的起始濃度相同時(shí)，隨著梯度陡度的上升，右美托咪定在該色譜柱上的分析時(shí)間逐漸變短，峰形變窄且響應(yīng)逐漸提高[9]。實(shí)驗(yàn)中采取B相的起始濃度為20%，以梯度陡度30%進(jìn)行梯度洗脫程序，參考Shimadzu Prominenece UFLC（LC-20 AD泵）的耐受壓力，考慮到分析所用的時(shí)間，流動(dòng)相的流速采用1.2 mL/min。通過(guò)上述條件，右美托咪定在該色譜柱上的保留時(shí)間為3.09 m i n，如圖1所示。

質(zhì)譜條件：配置100 ng/mL的右美托咪定的標(biāo)準(zhǔn)品，選擇E S I+模式，利用針泵直接進(jìn)樣分析，優(yōu)化質(zhì)譜條件。在一級(jí)全掃描質(zhì)譜條件下，通過(guò)手動(dòng)去改變?nèi)ゴ仉妷篋P，得到右美托咪定的母離子質(zhì)量數(shù)[M+H]+是m/z 201.1；在確定母離子的基礎(chǔ)上，經(jīng)Product Ion MS 2獲得二級(jí)質(zhì)譜，手動(dòng)改變碰撞電壓C E，使母離子和子離子均具有一定的強(qiáng)度，選擇質(zhì)荷比較穩(wěn)定且強(qiáng)度較大的兩個(gè)碎片作為子離子，右美托咪定的定性離子對(duì)201.1/68.2和201.1/95.2；做MRMScan，通過(guò)設(shè)定去簇電壓D P和碰撞電壓C E的范圍，進(jìn)一步優(yōu)化該物質(zhì)的兩對(duì)離子對(duì)的D P和C E，獲得每對(duì)離子對(duì)的最優(yōu)D P和C E。由于主要碎片m/z 95.2的背景干擾較少且響應(yīng)強(qiáng)度較m/z 68.2更高，所以選擇201.1/95.2作為右美托咪定的定量離子對(duì)。最終優(yōu)化后的參數(shù)見(jiàn)表1。

表2 不同的洗脫條件及相關(guān)參數(shù)

圖1 右美托咪定的MRM色譜圖

3.2 方法的專屬性

選取不同來(lái)源的空白血樣6份于5 mL試管中，按照2.4步驟對(duì)血樣進(jìn)行處理，獲得空白血樣的MR M色譜圖，如圖2所示；向空白血液中加入一定濃度的右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)溶液，依2.4步驟操作，得到血液中添加右美托咪定后的MR M色譜圖，如圖3所示。結(jié)果顯示，在右美托咪定的出峰時(shí)間，空白血樣中沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)；空白血添加中右美托咪定的出峰時(shí)間是3.09 m i n，且兩對(duì)離子對(duì)m/z 201.1/95.2、m/z 201.1/68.2均出現(xiàn)，峰形良好且兩對(duì)離子對(duì)的相對(duì)豐度比符合要求。這表明建立該方法檢測(cè)血液中右美托咪定成分時(shí)，人體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)該物質(zhì)的檢測(cè)沒(méi)有干擾，該方法的專屬性較好。

3.3 方法的工作曲線

圖2 空白血樣的MRM色譜圖

圖3 血液中添加右美托咪定后的MRM色譜圖

選取響應(yīng)較高的離子對(duì)201.1/95.2進(jìn)行血液中右美托咪定成分的定量分析。取5份空白血樣各0.5 mL，依次添加不同濃度的右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為1、5、10、50、100 ng/mL的溶液，按照2.4的方法進(jìn)行操作，在優(yōu)化后的色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行定量檢測(cè)。以右美托咪定的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，溶液濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/x2，得到線性方程為y=2020 x+353(r=0.9984)。結(jié)果顯示：該方法分析血液中右美托咪定成分時(shí)，在1~100 ng/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，如圖4所示。

3.4 方法的檢出限

以信噪比S/N≥3，該方法對(duì)血液中右美托咪定的最低檢出限是0.2 ng/mL；以信噪比S/N≥10時(shí)，該方法對(duì)血液中右美托咪定的定量限是1 ng/mL，配置5份血液中濃度為1 ng/mL的樣品進(jìn)行測(cè)定，其準(zhǔn)確度是97.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差R S D%為6.37%。

圖4 右美托咪定的工作曲線

3.5 回收率和精密度

取空白血液0.5 mL，依次加入右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為1、10、50 ng/mL的樣品溶液，對(duì)每種濃度做3組平行樣，按照2.4的方法進(jìn)行前處理，在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下，進(jìn)行分析檢測(cè)，求得回收率；在同一天內(nèi)三個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析檢驗(yàn)，連續(xù)分析三天，得到日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果如表3所示。

表3 血液中右美托咪定的回收率和精密度

3.6 案例應(yīng)用

2017年1月，山東省德州市某區(qū)發(fā)生一起迷奸案件，送檢單位送檢了從現(xiàn)場(chǎng)提取的標(biāo)有“聽(tīng)話水”字樣的瓶子、受害人飲用過(guò)的飲料瓶及受害人的血液，要求進(jìn)行毒物成分定性定量分析。利用本實(shí)驗(yàn)室建立的上述方法對(duì)送檢檢材進(jìn)行檢驗(yàn)，從受害人的血液中檢出右美托咪定成分，含量為40 ng/mL。

4 結(jié)語(yǔ)

生物樣品由于基質(zhì)復(fù)雜，在分析過(guò)程中容易受到內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。本實(shí)驗(yàn)建立了一種超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)血液中右美托咪定成分進(jìn)行定性定量分析的方法，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式選取右美托咪定的兩對(duì)離子對(duì)，響應(yīng)強(qiáng)度高的一對(duì)離子對(duì)用于定量分析，檢測(cè)的專一性提高，雜質(zhì)的干擾較少，保證了定性定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。樣品前處理操作步驟簡(jiǎn)單快捷，處理時(shí)間短，有機(jī)溶劑用量少，不需要衍生化操作[9-11]。該檢驗(yàn)方法適用于實(shí)踐辦案中，對(duì)檢材血液中右美托咪定的快速定性定量分析。