，，，，

內(nèi)臟利什曼病(黑熱病)是由親內(nèi)臟的利什曼原蟲感染所致的嚴(yán)重危害人類健康的重要人獸共患寄生蟲病。利什曼病由媒介白蛉叮咬傳播。初始感染媒介的利什曼原蟲位于白蛉胃腸道，并無(wú)感染力，經(jīng)過發(fā)育繁殖利什曼原蟲逐漸獲得了感染力，一周后原蟲向白蛉消化道前部運(yùn)動(dòng)，并聚集在白蛉咽、口腔和喙部，當(dāng)白蛉叮咬人時(shí)將利什曼原蟲注入人體，侵入人體巨噬細(xì)胞而感染。因此，比較利什曼原蟲有毒株和無(wú)毒株前鞭毛體表達(dá)分子差異將有助于鑒定涉及感染的利什曼原蟲關(guān)鍵分子。

利什曼原蟲基因表達(dá)主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄后和翻譯后調(diào)節(jié),導(dǎo)致了基因、mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)間相關(guān)性程度極低[1]。通過對(duì)同一分離株的有毒株和無(wú)毒株進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析則易于發(fā)現(xiàn)和鑒定與感染相關(guān)的蛋白分子。利什曼原蟲在培養(yǎng)基中培養(yǎng)會(huì)逐漸失去毒力，最終失去對(duì)動(dòng)物模型的感染力，這些無(wú)毒株相似于媒介白蛉消化道內(nèi)無(wú)感染力的前鞭毛體；而分離的利什曼原蟲經(jīng)動(dòng)物傳代(取感染動(dòng)物的脾臟置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得的前鞭毛體再感染動(dòng)物，如此反復(fù))其前鞭毛體能始終保持著毒力。

非標(biāo)記(Label-free )定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是近年發(fā)展起來的較敏感的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)， 得到了廣泛的應(yīng)用[2]。本研究采用此蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較分析了分離于我國(guó)新疆伽師縣黑熱病患者的利什曼原蟲(嬰兒利什曼原蟲，致荒漠型黑熱病[3])有毒株和無(wú)毒株蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，其結(jié)果為篩選和鑒定與利什曼原蟲感染相關(guān)的關(guān)鍵分子奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1蟲株 嬰兒利什曼原蟲伽師株(MHOM/CN/08/JIASHI-5)于2008年分離于新疆伽師縣黑熱病患者，經(jīng)鑒定為嬰兒利什曼原蟲[3]。該地為荒漠型內(nèi)臟利什曼病疫區(qū)。該蟲株通過兩種方式在本實(shí)驗(yàn)室傳代，一是每3個(gè)月感染1次金色倉(cāng)鼠(購(gòu)買自上海松江淞聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所動(dòng)物中心飼養(yǎng)，經(jīng)過該所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批同意使用)，即取感染鼠脾臟體外3代次培養(yǎng)，獲取前鞭毛體再感染鼠，使其始終保持感染力(有毒株)，二是從2008年開始一直在NNN培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每月傳代1次，其前鞭毛體已失去了對(duì)動(dòng)物模型的感染力(無(wú)毒株)。

1.2試劑與儀器 199培養(yǎng)基干粉購(gòu)自德國(guó)Gibco，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)ScienCell，Hepes購(gòu)自上海怡成生物科技有限公司，瓊脂粉購(gòu)自香港Gene Company Ltd.，青霉素鈉、鏈霉素購(gòu)自石家莊華北制藥股份有限公司，氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、磷酸氫鈉及葡萄糖購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，DTT、Urea、IAA乙腈和BCA 蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，Trypsin購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Q-exacitve質(zhì)譜儀、HPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1000和色譜柱RP-C18購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 培養(yǎng)基的配制

1.3.1NNN培養(yǎng)基 取新西蘭兔血，去除纖維， 加入100單位/100 mL的青霉素鈉。3.4 g瓊脂粉、1 g氯化鈉及150 mL蒸餾水配置瓊脂凝膠。0.45 g氯化鈉、0.01 g氯化鈣、0.02 g氯化鉀、0.01 g碳酸氫鈉、0.125 g葡萄糖及50 mL蒸餾水配置洛克氏液。 1 mL前述兔血加入3 mL高壓滅菌的瓊脂凝膠，混勻后斜放在冰塊上冷卻，凝固形成斜面后每管再加入1 mL洛克氏液，存放于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2199培養(yǎng)基 將9.8 g M199培養(yǎng)基干粉加蒸餾水溶解，加入1.75 g碳酸氫鈉及5.96 g Hepes，完全溶解后定容至1 000 mL。胎牛血清56 ℃滅活30 min，每100 mL M199加入20 mL胎牛血清及100單位/100 mL 雙抗(青霉素及鏈霉素)。隨后應(yīng)用0.22 μm的濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4有毒株和無(wú)毒株鞭毛體的收集 取嬰兒利什曼原蟲伽師株第一代次感染的金色倉(cāng)鼠脾臟置NNN培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨后前鞭毛體再接種到199培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。在原蟲處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，原蟲密度約為106/mL時(shí)，4 ℃下以3 000 g離心15 min收集有毒株前鞭毛體，用PBS洗3次后備用。同法收集NNN培養(yǎng)基傳代的伽師無(wú)毒株鞭毛體。

1.5蛋白質(zhì)的制備 有毒株和無(wú)毒株各取100 μL壓積量，分別加入500 μL STD buffer(4% SDS,1 mmol/L DTT, 150 mmol/L Tris-HCl pH8.0)，勻漿混勻，沸水浴5 min。超聲破碎(80 w，超聲10 s，間歇15 s，共10次)沸水浴5 min，離心取上清，BCA法蛋白質(zhì)定量。取約20 μg SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.6蛋白質(zhì)的FASP酶解 蛋白質(zhì)的酶解方法參照文獻(xiàn)[4]。取200 μg樣品，加入 DTT至終濃度為100 mmol/L，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入200 μL UA buffer(8 mol/L Urea，150 mmol/L Tris-HCl pH8.0)混勻，轉(zhuǎn)入10 kd超濾離心管，離心14 000 g 15 min。加入200 μL UA buffer離心14 000 g 15 min，棄濾液。加入100 μL IAA(50 mmol/L IAA in UA)，600 r/min振蕩1 min，避光室溫30 min，離心14 000 g 10 min。加入100 μL UA buffer，離心14 000 g 10 min重復(fù)2次。加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3，離心14 000 g 10 min重復(fù)2次。加入40 μL Trypsin buffer(4 μL Trypsin in 40 μL NH4HCO3)，600 r/min振蕩1 min，37 ℃ 16～18 h。換新收集管，離心14 000 g 10 min，取濾液，OD280肽段定量。

1.7酶解產(chǎn)物的LC-MS/MS分析 分析方法參照文獻(xiàn)[5]。取2 μg酶解后產(chǎn)物采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1000進(jìn)行分離。液相A液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為2%)，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm (RP-C18)以100%的A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到Thermo EASY column SC001 traps 150 μm×20 mm (RP-C18)，再經(jīng)色譜柱分離，流速為300 nL/min。相關(guān)液相梯度如下：0～110 min，B液線性梯度從0%到45%；110～117 min，B液線性梯度從45%到100%；117～120 min，B液維持在100%。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)：120 min，檢測(cè)方式：正離子，母離子掃描范圍：300～1 800 m/z，多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：MS1在M/Z 200時(shí)分辨率為70 000，AGC target：3e6，一級(jí)Maximum IT：10 ms，Number of scan ranges ：1，Dynamic exclusion：40.0 s；每次全掃描(full scan)后采集20個(gè)碎片圖譜，二級(jí)在M/Z 200時(shí)分辨率為17 500，MS/MS Activation Type：HCD，Isolation window：2 m/z，Microscans：1，二級(jí)Maximum IT ：60 ms，Normalized collision energy：30eV，Underfill ratio：0.1%。

1.8MaxQuant查庫(kù) 原始文件導(dǎo)入MaxQuant軟件(版本號(hào)1.3.0.5)進(jìn)行查庫(kù)[6]。查庫(kù)所用的數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot_Leishmania_genus_50931_20160303 .fasta (蛋白質(zhì)序列50 931條，下載日期20160303)。

1.9生物信息學(xué)分析 MaxQuant所得的查庫(kù)文件使用Perseus軟件進(jìn)行分析，Perseus軟件版本號(hào)為1.3.0.5。使用Omicsbean(http://www.omicsbean.cn/)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生信分析，包括GO富集和KEGG富集分析[7]。

1.10統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)兩組樣品進(jìn)行t檢驗(yàn)(雙側(cè))，差異倍數(shù)>1.2或者差異倍數(shù)<0.83,且P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1蛋白質(zhì)鑒定 利用Label-free定量蛋白組學(xué)技術(shù)共成功鑒定蛋白3 994個(gè)(舍棄只有一次有LFQ值的蛋白)，其中有毒株3 720個(gè)蛋白，無(wú)毒株3 827個(gè)蛋白。利用SPSS軟件篩選出有毒株和無(wú)毒株之間差異表達(dá)蛋白，共298個(gè)(差異倍數(shù)>1.2或者差異倍數(shù)<0.83，P<0.05)，其中利什曼原蟲有毒株特有表達(dá)蛋白15個(gè)，無(wú)毒株特有表達(dá)蛋白23個(gè)(圖1)。二者間差異表達(dá)蛋白260個(gè)，其中有毒株表達(dá)上調(diào)蛋白78個(gè)，表達(dá)下調(diào)蛋白182個(gè)。

圖1 利什曼原蟲伽師有毒株和無(wú)毒株差異表達(dá)蛋白韋恩圖Fig.1 Venn diagram of differentially expressed proteins between the virulent promastigotes and avirulent promastigotes in the Jiashi Leishmania strain

2.2差異表達(dá)蛋白功能注釋 對(duì)有毒株和無(wú)毒株差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，只在有毒株表達(dá)而在無(wú)毒株不表達(dá)的蛋白有15個(gè)，其中13個(gè)為未命名蛋白，另外2個(gè)蛋白分別是甲基丙二酸單酰CoA差向異構(gòu)酶(Methylmalonyl-CoA epimerase，MMCE)和乙酰轉(zhuǎn)移酶，均參與代謝和生物合成。只在無(wú)毒株表達(dá)而在有毒株不表達(dá)的蛋白有23個(gè)， 其中13個(gè)為未命名蛋白，另外10個(gè)蛋白分別參與下列活動(dòng) :1)代謝和生物合成(MP67、穹隆體主蛋白、胞質(zhì)FE-S簇裝配因子NUBP1同源物、3-β-羥基甾體-δ(8)，δ(7)異構(gòu)酶、鈣蛋白酶樣半胱氨酸肽酶和外切體復(fù)合物核酸外切酶Rrp40);2)定位和轉(zhuǎn)運(yùn)(網(wǎng)格蛋白裝配蛋白和tRNA(鳥嘌呤(37)-N1)甲基轉(zhuǎn)移酶);3)細(xì)胞膜/細(xì)胞骨架形成(動(dòng)力蛋白輕鏈蛋白和肌球蛋白-IB重鏈)。有毒株表達(dá)上調(diào)蛋白主要參與細(xì)胞氮化合物代謝、細(xì)胞氮化合物生物合成、細(xì)胞酰胺代謝等生物過程；具有核酸結(jié)合、RNA結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性等分子功能；存在于細(xì)胞內(nèi)成分、細(xì)胞質(zhì)、非膜結(jié)合細(xì)胞器等細(xì)胞組分中(圖2)。有毒株表達(dá)下調(diào)蛋白其功能主要涉及有機(jī)酸代謝、酮酸代謝、羧酸代謝等生物過程；具有催化活性、氧化還原酶活性、內(nèi)肽酶活性等分子功能；存在于細(xì)胞內(nèi)成分、細(xì)胞器、線粒體等細(xì)胞組分中(圖3)。

圖2 有毒株表達(dá)上調(diào)蛋白的生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能富集圖Fig.2 Biological process, cell composition and molecular function enrichment diagram of up-regulated proteins in virulent strain

圖3 有毒株下調(diào)蛋白的生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能富集圖Fig.3 Biological process, cell composition and molecular function enrichment diagram of down-regulated proteins in virulent strain

2.3差異表達(dá)蛋白通路富集分析 對(duì)有毒株表達(dá)上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白分別進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，結(jié)果顯示表達(dá)上調(diào)蛋白參與了核糖體、吞噬體、醚脂代謝等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(圖4)；表達(dá)下調(diào)蛋白參與了丙酮酸代謝、次生代謝物的生物合成、抗生素的生物合成等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(圖5)。

圖4 有毒株表達(dá)上調(diào)蛋白的通路富集圖Fig.4 Pathways enrichment diagram of up-regulated proteins in virulent strain

圖5 有毒株表達(dá)下調(diào)蛋白的通路富集圖Fig.5 Pathways enrichment diagram of down-regulated proteins in virulent strain

3 討 論

本研究應(yīng)用非標(biāo)記高通量蛋白質(zhì)組研究技術(shù)對(duì)分離于我國(guó)新疆伽師縣致荒漠型黑熱病的利什曼原蟲有毒株和無(wú)毒株進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定蛋白3 994個(gè)，遠(yuǎn)高于其他蛋白質(zhì)組方法鑒定的蛋白數(shù)[8]。本研究結(jié)果顯示，298個(gè)蛋白在有毒株和無(wú)毒株間的表達(dá)存在差異(特異表達(dá)或表達(dá)豐度差異)。這些差異表達(dá)蛋白中確定功能的蛋白分別參與糖與脂質(zhì)代謝、核酸代謝、壓力反應(yīng)、細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞周期與增殖等活動(dòng)。

甲基丙二酸單酰CoA差向異構(gòu)酶只在有毒株特異表達(dá)，此蛋白與降解奇鏈脂肪酸相關(guān)[9]。磷酸甘露聚糖酶在有毒株表達(dá)上調(diào)，此蛋白催化甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為甘露糖-1-磷酸,這是真核生物甘露醇的激活和糖復(fù)合物的生物合成的重要步驟。磷酸甘露聚糖酶缺失的墨西哥利什曼原蟲失去毒力，表明該蛋白是重要的毒力因子[10]。肌醇鞘磷脂磷脂酶C(Inositol phosphosphingolipid phospholipase C-Like，ISCL)在有毒株中高表達(dá)，研究表明ISCL缺失的碩大利什曼原蟲不能使易感的BALB/c小鼠感染急性期產(chǎn)生病理改變[11]。ISCL介導(dǎo)的肌醇磷酸神經(jīng)酰胺(inositol phosphorylceramide，IPC)的降解在養(yǎng)分耗盡時(shí)對(duì)利什曼原蟲的生長(zhǎng)起重要作用，并提高利什曼原蟲的耐酸機(jī)能[12]。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧和氮類物質(zhì)(ROS和RNS)是殺滅細(xì)胞內(nèi)病原體的最常見的武器。而利什曼原蟲作為巨噬細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體具有通過抵抗感染過程中產(chǎn)生的有毒氧代謝物以增強(qiáng)生存能力的機(jī)制。在這種抗氧化機(jī)制中，多胺很大程度上取決于細(xì)胞內(nèi)L-精氨酸的有效性。本研究顯示在有毒株S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)表達(dá)上調(diào)，此蛋白是利什曼原蟲多胺合成的一個(gè)關(guān)鍵酶[13-14]。另一個(gè)上調(diào)蛋白精氨琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase，ASS)是與利什曼原蟲發(fā)病機(jī)制相關(guān)的活性酶，可以將細(xì)胞內(nèi)L-瓜氨酸轉(zhuǎn)化為精氨琥珀酸鹽以提供精氨酸，表明ASS是利什曼原蟲能在壓力環(huán)境中生存的重要蛋白，有望被用作抗利什曼原蟲藥物靶標(biāo)[15-16]。上調(diào)蛋白抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)是抗氧化酶類，在分解過氧化氫中起關(guān)鍵作用[17-18]。無(wú)鞭毛蛋白(amastin)在有毒株高表達(dá)，此蛋白是由利什曼原蟲基因組中巨大的基因家族編碼的表面糖蛋白。有研究顯示敲除編碼無(wú)鞭毛蛋白基因的巴西利什曼原蟲在小鼠巨噬細(xì)胞體外感染中表現(xiàn)為生長(zhǎng)障礙而不能感染BALB/c小鼠[19]。表面蛋白2(Parasite surface antigen protein 2,PSA-2)是利什曼原蟲的一個(gè)毒力因子，參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠抵制補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用，增強(qiáng)利什曼原蟲感染宿主的能力[20-22]。在本研究中PSA-2在有毒株中高表達(dá)。另有研究表明杜氏利什曼原蟲分離株中PSA-2的過表達(dá)導(dǎo)致銻劑敏感株轉(zhuǎn)變?yōu)榭逛R株，提示PSA-2可以作為區(qū)分對(duì)銻劑敏感株和抗性株的分子標(biāo)志物[23]。

綜上所述，通過比較利什曼原蟲伽師有毒株和無(wú)毒株蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)兩者蛋白質(zhì)組存在相當(dāng)差異性，在有毒株高表達(dá)的蛋白大都是毒力因子，涉及利什曼原蟲對(duì)宿主細(xì)胞的感染及在感染細(xì)胞中生存，從而賦予利什曼原蟲毒力。下一步擬對(duì)一些有代表性的與利什曼原蟲感染相關(guān)的關(guān)鍵分子基因進(jìn)行Real time PCR驗(yàn)證是否在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)或下調(diào)；應(yīng)用Western blot進(jìn)一步證實(shí)這些關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)水平是否上調(diào)或下調(diào)，對(duì)驗(yàn)證成功的蛋白通過基因敲除的方法進(jìn)行進(jìn)一步研究，不僅可為篩選和鑒定與利什曼原蟲感染相關(guān)關(guān)鍵分子奠定基礎(chǔ)，而且為抗利什曼病的疫苗和藥物的研究提供靶分子。

利益沖突：無(wú)