何佳珂，陳志青，萬蓉，饒美英，熊愛珍，洪葵

(南昌大學第二附屬醫(yī)院1.心內(nèi)科；2.藥學部；3.分子醫(yī)學重點實驗室；4.輸血科，南昌 330006)

新型口服抗凝藥利伐沙班是第一個口服直接Xa因子抑制劑，可抑制凝血酶生成[1]。用于預防髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者深靜脈血栓(deep vein thrombosis，DVT)和肺栓塞(pulmonary embolism，PE)的形成[2-4]。也可用于預防非瓣膜性心房顫動(房顫)患者腦卒中和非中樞神經(jīng)系統(tǒng)性栓塞，降低冠狀動脈綜合征復發(fā)的風險等[5-6]。一般說來，利伐沙班安全有效，但是臨床常用指標如凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血酶原時間(activated partial prothrombin time，APTT)、國際標準化比值(international normalized ratio，INR)等不能反映利伐沙班的抗凝作用[7]，指南不建議服用利伐沙班患者進行上述檢測[5]?？紤]利伐沙班的血漿濃度同其抑制Xa因子活性的程度密切相關(guān)[5，7]，對利伐沙班進行血藥濃度監(jiān)測，尤其是針對高齡、肝腎功能不全的患者進行常規(guī)監(jiān)測，將有助于評價利伐沙班的抗凝效果，促進臨床安全有效用藥。串聯(lián)質(zhì)譜法具有分析性能強、分析速度快以及靈敏度高等優(yōu)點[8-14]，筆者在本實驗建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)定量分析方法，測定人血漿利伐沙班濃度，以期為臨床藥物相互作用評價和個體化用藥實踐提供方法學參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 API4000+型三重四極桿質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源(Electron Spray Ionization，ESI)及Analyst 2.0.7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司) ；Nexera X2 UHPLC LC-30AD 液相泵(日本島津公司)；SIL-30AC自動進樣器(日本島津公司)；CTO-30A柱溫箱(日本島津公司)；BS124S電子天平(賽多利斯Sartorious公司，感量：0.1 mg)。

1.2試藥 利伐沙班標準品(Toronto Research Chemicals公司，批號：14-XJZ-49-1，含量：99.54%，規(guī)格：10 mg)；d4-利伐沙班標準品(Toronto Research Chemicals公司，批號：9-JHY-173-5，含量：98%，同位素含量：96.9%，規(guī)格：1 mg)；甲醇、乙腈為質(zhì)譜純(美國Thermo Scientific公司)；醋酸銨、甲酸為色譜純(美國Thermo Scientific公司)。超純水(18.2 MΩ)由Millipore 純水裝置制得。空白人血漿來自我院輸血科。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm，柱號：25002-102130)；柱溫：40 ℃；流動相：A相為水(含5 mmol·L-1醋酸銨和0.1%甲酸)，B相為乙腈；梯度洗脫：0～0.4 min，B10%；>0.4～0.8 min，B 10%→80%；>0.8～2 min，B80%；>2～2.1 min，B 80%→10%；>2.1～3 min，B10%；流速：0.4 mL·min-1；進樣量：5 μL。

2.2質(zhì)譜條件 采用ESI -正離子電離-多反應離子監(jiān)測(multi-reaction monitoring，MRM)的掃描檢測，利伐沙班與d4-利伐沙班的檢測離子分別為m/z436.1→m/z145.1和m/z440.2→m/z145.0。離子源電壓5500 V；溫度450 ℃；碰撞氣體(CAD)62.055 kPa；氣簾氣(CUR)172.375 kPa；源內(nèi)氣體1(GS1，N2)448.175 kPa，氣體2 (GS2，N2)379.225 kPa；去簇電壓分別為95 V(利伐沙班)和120 V(d4-利伐沙班)；碰撞能量分別為40 V(利伐沙班)和43 V(d4-利伐沙班)；掃描時間100 ms。

2.3標準溶液的配制 精密稱取利伐沙班和d4-利伐沙班，乙腈為溶劑，配制利伐沙班和d4-利伐沙班濃度分別為1和1.07 mg·mL-1儲備液，梯度稀釋，配制利伐沙班標準溶液濃度分別為10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000 ng·mL-1工作液；d4-利伐沙班(內(nèi)標)工作液濃度為2668 ng·mL-1。

2.4樣品的處理與測定 取人血漿樣品100 μL至1.5 mL離心管，加入內(nèi)標d4-利伐沙班(266.8 ng·mL-1)10 μL，混勻后加入乙腈300 μL，渦旋振蕩5 min，4 ℃16 000×g離心15 min，取上清液5 μL進樣，測定血漿中利伐沙班的濃度。

2.5方法學驗證

2.5.1專屬性考察 按“2.4”項下操作，在本實驗條件下，利伐沙班和內(nèi)標d4-利伐沙班的保留時間約為1.81 min。通過對來自6個不同個體的空白血漿測定，表明血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾樣品測定，空白血漿、空白血漿添加利伐沙班和d4-利伐沙班標準品色譜質(zhì)譜圖見圖1。

2.5.2標準曲線的繪制 制備利伐沙班血漿濃度分別為1，2，5，10，20，50，100，200，500 ng·mL-1的血漿樣品。按“2.4”項操作，以樣品和內(nèi)標峰面積比(As/Ais)為縱坐標，濃度(C，ng·mL-1) 為橫坐標，以1/C2為權(quán)重系數(shù)進行回歸，得血漿中利伐沙班標準曲線，結(jié)果利伐沙班在1～500 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。回歸方程為：Y=0.014 8X+0.009 93，R2=0.9964，其中Y為樣品和內(nèi)標峰面積比(As/Ais)，X為利伐沙班濃度。

2.5.3定量下限 制備利伐沙班濃度為1 ng·mL-1的血漿樣品(n=5)，按“2.4”項操作，將滿足測定3～5個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1/10～1/20時藥物濃度作為本測定方法的定量下限，經(jīng)測定本方法的利伐沙班的定量下限為1 ng·mL-1。

2.5.4精密度與準確度 制備利伐沙班濃度分別為2，50，400 ng·mL-1的血漿樣品。按“2.4”項操作，測定日內(nèi)變異和日間(連續(xù)考察3 d)變異。并將測定結(jié)果代入血漿標準曲線算出測定濃度，測定濃度與加入濃度相比，計算血漿利伐沙班準確度。結(jié)果顯示，日內(nèi)和日間精密度和準確度均<8%，符合生物樣品分析要求，見表1。

圖1A.空白血漿；B.空白血漿加利伐沙班(1ng·mL-1)和d4-利伐沙班(tR內(nèi)標=1.81min；tR利伐沙班=1.81min)的超高效液相色譜-質(zhì)譜圖

A.blank plasma; B.blank plasma spiked with rivaroxaban at 1 ng·mL-1and d4- rivaroxaban

Fig.1UPLC-MS/MSchromatogramsofrivaroxabanandrivaroxabaninhumanplasmaatd4

2.5.5絕對回收率 制備利伐沙班濃度分別為2，50，400 ng·mL-1的血漿樣品。按“2.4”項操作，測定結(jié)果的峰面積與相同濃度標準品溶液直接進樣的峰面積相比，算得血漿中利伐沙班絕對回收率。結(jié)果表明，各濃度絕對回收率為90.09%～95.23%(表2)。

2.5.6基質(zhì)效應 用空白血漿的乙腈提取液制備利伐沙班濃度分別為2，50，400 ng·mL-1樣本，按“2.4”項操作，以水溶液制備相同3種濃度樣本得到相應溶液的峰面積。上述樣品每個濃度各配制6份測定，以乙腈提取液配制低、中、高濃度樣品中利伐沙班和內(nèi)標的峰面積與水溶液平均峰面積比值，評價血漿基質(zhì)對測定的影響。結(jié)果顯示3種濃度血漿樣品利伐沙班的基質(zhì)效應在93.50%～100.09%，內(nèi)標d4-利伐沙班基質(zhì)效應為104.66%，本試驗條件下不存在明顯基質(zhì)效應，見表2。

表1血漿中利伐沙班定量下限、精密度和準確度測定結(jié)果

Tab.1Lowerlimitofquantitation,precisionandaccuracyofrivaroxabaninplasmasamples

%

*1代表定量下限

*1represents lower limit of quantification

表2血漿中測定利伐沙班的絕對回收率和基質(zhì)效應測定結(jié)果

Tab.2Absoluterecoveryandmatrixeffectonquantificationofrivaroxabaninplasmasamples

%，n=6

2.5.7樣品穩(wěn)定性考察 制備利伐沙班血漿濃度分別為2，50，400 ng·mL-1血漿樣品。分別進行室溫穩(wěn)定性試驗(20 ℃放置4 h)、處理后穩(wěn)定性試驗(4 ℃放置24 h)、冷凍穩(wěn)定性試驗(-80 ℃冷凍放置50 d)和凍融穩(wěn)定性試驗(反復凍融處理3次)，然后按“2.4”項操作，將測定結(jié)果的峰面積比代入血漿標準曲線計算實測值，評估樣品的室溫、處理后、冷凍放置和反復凍融穩(wěn)定性。結(jié)果表明實測值與加入量基本一致，說明利伐沙班在各條件下放置穩(wěn)定(表3)。

3 討論

筆者在本實驗中建立了簡便的蛋白沉淀法聯(lián)合UPLC-MS/MS測定人血漿利伐沙班濃度，以期轉(zhuǎn)化應用于臨床實踐。本方法定量下限為1 ng·mL-1，靈敏度更高[8-12]，適合對人血漿中痕量利伐沙班進行定量檢測。血漿樣品處理過程采用乙腈沉淀血漿蛋白，提取回收率90.09%～95.23%，方法穩(wěn)定性好，與固相萃取相比[13-14]，操作簡便、快速，成本低，大大降低了樣品處理過程中污染的可能性，適用于大量生物樣本的快速處理，可確保臨床測定的準確性。

表3血漿利伐沙班樣品穩(wěn)定性實驗結(jié)果

Tab.3Stabilityresultsofrivaroxabaninplasmasamples

%，n=5

同時，為更好適應臨床樣品分析需求，提高化合物響應，在液相色譜條件優(yōu)化過程中采用梯度洗脫方式，并發(fā)現(xiàn)流動相水相加入5 mmol·L-1醋酸銨和0.1%甲酸后，利伐沙班色譜峰尖銳、對稱。本方法分析時間僅為3 min，顯著短于文獻報道的HPLC-MS/MS方法[8，10-12，14]，可為臨床大樣本和復雜基質(zhì)組分的分析節(jié)約時間。利伐沙班和內(nèi)標d4-利伐沙班具有較好的色譜行為，保留時間1.81 min，血漿中基質(zhì)對測定無干擾，方法選擇性好。