李琬婷 黃曉霞 程小毛

摘要：選取雄黃連木（Pistacia chinensis Bunge）為研究材料，利用10對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）引物對(duì)來自河南省的6個(gè)不同種群總計(jì)136份雄黃連木個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，從不同層次揭示其變異規(guī)律以及為后期黃連木雌雄鑒定和合理利用提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，物種水平上，Shannon信息指數(shù)Ⅰ（0.49）和基因多樣性指數(shù)（0.33）均反映出雄黃連木種群具有中等遺傳多樣性水平。分子方差分析（AMOVA）結(jié)果表明，雄黃連木種群內(nèi)的遺傳變異占93.35%，種群間的變異占6.65%，二者都說明該地區(qū)黃連木的遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)部。6個(gè)黃連木群體間的遺傳距離范圍在0.035 3～0.149 5之間，遺傳相似性的范圍在0.861 1～0.965 3之間，基因流Nm為2.612 6，說明黃連木不同群體間相似程度較高，遺傳分化較低，基因交流較充分。

關(guān)鍵詞：黃連木;AFLP;遺傳變異;遺傳分化

中圖分類號(hào)： S792.990.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0133-04

黃連木（Pistacia chinensis Bunge）系漆樹科（Anacardiaceae）黃連木屬（Pistacia）落葉喬木，雌雄異株，是廣泛分布于我國(guó)的生物能源樹種之一[1]。在能源危機(jī)日益加劇的今天，對(duì)生物柴油能源植物進(jìn)行利用研究具有極其重要的價(jià)值與意義，黃連木作為一種優(yōu)良的木本油料樹種，顯示出其廣闊的開發(fā)利用前景，受到廣泛的關(guān)注[2-3]。對(duì)于雌雄異株植物而言，一般雄株生長(zhǎng)得更快且有更好的適應(yīng)性[4]，通過對(duì)雌雄黃連木的合理搭配，來滿足當(dāng)前對(duì)黃連木種群大面積繁育的需要，雌雄植株黃連木性別發(fā)育很難通過形態(tài)學(xué)特征來進(jìn)行鑒別，故對(duì)雄黃連木進(jìn)行遺傳多樣性研究具有極高價(jià)值。由于過去對(duì)黃連木的研究相對(duì)落后，主要集中于栽培管養(yǎng)[5]、病蟲害防治[6]、生理特性[7]以及資源分布[8]等方面，有關(guān)其雌雄植株遺傳多樣性或遺傳改良的研究國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道，李琬婷等利用9對(duì)AFLP引物對(duì)河南省4個(gè)不同種群黃連木材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究結(jié)果表明黃連木4個(gè)不同種群遺傳多樣性均處于中等水平，黃連木總的遺傳分化主要來自居群內(nèi)部，較低遺傳分化則在其居群間存在[9]。

在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（RAPD）和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）基礎(chǔ)上不斷完善發(fā)展的分子技術(shù)-擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記技術(shù)，兼?zhèn)銻APD與RFLP技術(shù)雙重優(yōu)點(diǎn)，可在不預(yù)知基因組序列情況下，對(duì)基因組多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，不僅易于標(biāo)準(zhǔn)化，且所檢出的多態(tài)位點(diǎn)同RAPD標(biāo)記一樣可覆蓋整個(gè)基因組，也具RFLP同樣的可靠性及穩(wěn)定性[10]。該項(xiàng)技術(shù)發(fā)展至今已成功用于多種植物遺傳多樣性、高密度遺傳圖譜構(gòu)建以及分子標(biāo)記篩選的研究。隨著分子技術(shù)的不斷進(jìn)步完善，AFLP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定、遺傳多態(tài)性檢測(cè)、遺傳圖譜構(gòu)建以及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等諸多方面，不僅應(yīng)用在小麥、水稻、玉米等主要農(nóng)作物上，在林木、果樹及蔬菜等植物上也得到廣泛利用[11-14]。程小毛等應(yīng)用AFLP技術(shù)對(duì)6個(gè)居群的滇西北玉龍雪山不同海拔川滇高山櫟進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，6個(gè)居群的遺傳多樣性水平隨海拔梯度的變化而呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律[15]。魏朔南等通過8對(duì)引物組合將陜西漆樹8個(gè)品種和6個(gè)野生居群的14個(gè)樣品完全區(qū)分開[16]。本研究通過采用AFLP技術(shù)對(duì)河南省不同地域雄黃連木進(jìn)行遺傳多樣性分析，從而為了解不同地理地域?qū)π埸S連木遺傳多樣性和親緣關(guān)系的影響，揭示其變異規(guī)律以及后期雌雄黃連木鑒定和合理利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為雄黃連木植株，于2015年3月在我國(guó)河南省長(zhǎng)葛市和安陽(yáng)市南溝村（西溝北坡）、南溝、南溝（東后凹）、南溝村（陳家溝）以及安陽(yáng)監(jiān)獄共6個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行采集，采集數(shù)分別為23、32、12、18、17、34株，共計(jì)136株。每株采其嫩梢 1～5個(gè)嫩枝，且取樣點(diǎn)間距≥30 m。將采集樣品迅速放進(jìn)變色硅膠進(jìn)行干燥處理，帶回實(shí)驗(yàn)室常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雄黃連木DNA抽提 采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[17]提取雄黃連木基因組總DNA。

1.2.2 雄黃連木AFLP分析 參照李琬婷等的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序[9，18]，進(jìn)行AFLP相關(guān)分析。選擇性擴(kuò)增引物編號(hào)及序列見表1。

1.2.3 帶型統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)分析 采用人工讀帶法，將凝膠電泳圖上難以分辨的弱帶或無(wú)帶記作“0”，同一位置的清晰條帶記作“1”，據(jù)此構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣。利用POPEGENE Version1.31軟件進(jìn)行綜合分析，計(jì)算有效等位基因數(shù)（Ne）、等位基因數(shù)（Na）、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)（I）、遺傳分化系數(shù)（Gst）、Neis多樣性指數(shù)（He）、基因流（Nm）以及遺傳距離（D）等相關(guān)參數(shù)。采用AMOVA軟件分析樣品遺傳變異在群體內(nèi)與群體間的分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄黃連木遺傳多樣性分析

利用EA16MC8、EA16MC12、EA15MC9、EA13MC5、EA13MC8、EA13MC10、EA13MC12、EA12MC15、EA11MC1、EA11MC14這10對(duì)篩選出的AFLP引物組合，對(duì)來自6個(gè)不同雄黃連木種群的136株樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析。研究結(jié)果（表2）表明，10對(duì)引物的有效等位基因數(shù)（Ne）變異區(qū)間在1.28（EA13/MC12）～1.70（EA16/MC8），變幅為0.42，平均值為1.56;香農(nóng)指數(shù)（I）最大的位點(diǎn)是EA16/MC8，為0.58，最小的是EA13/MC12，為0.26，平均值為0.49;而Neis基因多樣性指數(shù)（He）的變化范圍在0.17（EA13/MC12）～0.39（EA16/MC8），AFLP檢測(cè)的結(jié)果說明雄黃連木種質(zhì)資源具有中等水平的遺傳多樣性。

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收稿日期：2018-08-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31100292）;云南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2010ZC267）;云南省省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科園林植物與觀賞園藝建設(shè)經(jīng)費(fèi)（編號(hào)：50097401）。

作者簡(jiǎn)介：李琬婷（1993—），女，云南昆明人，碩士，主要從事園林植物應(yīng)用研究。E-mail：2861283663@qq.com。

通信作者：程小毛，博士，副教授，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail：30375713@qq.com。