李芬 王輝 李文麗 王富

摘要：以筋腐病易感高代自交系C285和抗病高代自交系P31的果實為材料，研究了番茄果實不同發(fā)育時期木質(zhì)素含量的差異、果實中CAD基因的預測及2個CAD基因的相對表達。結(jié)果表明，C285果實中木質(zhì)素含量在轉(zhuǎn)色期時達到峰值，紅熟期略有降低，而P31果實中的木質(zhì)素含量在綠熟期、轉(zhuǎn)色期及紅熟期變化較小，綠熟期含量最低、紅熟期最高;利用擬南芥CAD基因作為參考基因，在番茄中共查詢到5個CAD旁系同源基因，且在核酸水平與擬南芥中同源基因間的一致性為66.7%;5個CAD基因在2份材料中存在13個突變位點，其中Solyc01g107590（CAD590）和Solyc03g078440（CAD440）突變位點較多;CAD590和CAD440在P31的綠熟期和轉(zhuǎn)色期相對表達量較為穩(wěn)定，在紅熟期則大幅升高，而2個基因在C285中則均呈下降趨勢，其中CAD440降幅更大;綠熟期CAD590和CAD440在C285中相對表達量與P31相比分別高出2倍和5倍，轉(zhuǎn)色期P31中CAD590和CAD440則分別高于C285同期的表達量，其增幅分別為44.4%、130%、170%;而紅熟期2個基因的相對表達量在P31材料中差異較小。因此推斷CAD基因的表達與木質(zhì)素含量之間存在一定關(guān)系。

關(guān)鍵詞：番茄;筋腐病;木質(zhì)素;肉桂醇脫氫酶（CAD）;基因表達與分析

中圖分類號： S436.412.1+9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0081-04

隨著人們對于番茄需求量的增加，番茄的栽培面積在不斷擴大，尤其是設(shè)施栽培面積逐年增加，但病害也層出不窮，近年來，番茄筋腐病成為嚴重制約番茄生產(chǎn)的一類生理性病害，影響番茄果實的商品價值，成為迫切需要解決的問題。番茄筋腐病，也稱條腐病，一般發(fā)生在冬、春季的設(shè)施保護地與露地，主要危害果實，但葉片和莖在外觀上并無明顯變化。1921年，這種病害被首次提及，隨后在世界上廣為報道。Bewley等得出番茄筋腐病產(chǎn)生的重要因素是缺鉀[1]。但同時有研究表明僅多施鉀肥不能徹底解決問題。1958年，日本的農(nóng)學家首次在該國發(fā)現(xiàn)番茄筋腐病，隨后發(fā)現(xiàn)致病的其中一個關(guān)鍵原因是保護地長期連作。該病在果實上表現(xiàn)出褐變型筋腐果與白變型筋腐果2種類型。研究發(fā)現(xiàn)引起番茄筋腐病發(fā)生的因素包括番茄品種、溫度、光照時間、光照度、CO2含量、土壤理化性質(zhì)、施肥種類等。

木質(zhì)素（lignin），是酚類多聚體，植物體內(nèi)的大分子物質(zhì)，由肉桂醇單體集聚而成，有運輸水分與礦物質(zhì)、增強機械強度及抵御不良環(huán)境的作用。木質(zhì)素的生物合成途徑由2步組成：在細胞質(zhì)中，通過一系列酶催化，苯丙氨酸或酪氨酸逐步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素單體，然后被轉(zhuǎn)運到細胞壁通過脫氫聚合成木質(zhì)素[2]。肉桂醇脫氫酶（cinamyl alcohol dehydrogenase，簡稱CAD）是木質(zhì)素合成途徑中最早研究的酶類之一，主要在木質(zhì)素單體合成過程中的最后一步起作用[3-4]。CAD基因存在同源基因，擬南芥中CAD類似基因有17個，9個基因（AtCAD1～AtCAD9）與煙草和火炬松存在70%相似，為真正CAD基因，余下8個基因（AtCAD101～AtCAD108）為相似基因[5]。大多數(shù)植物中，CAD底物類似物被抑制活性后，植物抗病能力減弱，易感染病原菌。

目前，CAD對木質(zhì)素的合成、調(diào)控已取得較好成效，主要在楊樹、水稻、小麥中的改良品種、抗病方面的研究，但CAD基因的表達與分析對番茄筋腐病所產(chǎn)生的影響以及如何指導番茄育種的報道還非常少。因此本試驗以番茄筋腐病易感高代自交系C285和抗病高代自交系P31為試驗材料，通過對木質(zhì)素代謝關(guān)鍵基因CAD的分析，研究番茄筋腐病果實與正常果實在相對基因表達量上的差異分析;研究抗感番茄筋腐病果實在綠熟、轉(zhuǎn)色及紅熟期果實中基因CAD的表達，探討番茄筋腐病發(fā)生過程中木質(zhì)素生物合成與哪些基因的異常表達有關(guān)，從而揭示筋腐病發(fā)生的分子機制，達到從分子角度進行預防的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用的2份番茄材料為青島農(nóng)業(yè)大學大學園藝學院番茄課題組提供的筋腐病易感高代自交系C285和抗病高代自交系P31。

1.2 試驗方法

1.2.1 木質(zhì)素含量測定方法 本試驗中通過木質(zhì)素（lignin）含量試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定木質(zhì)素含量。

1.2.2 CAD基因的預測及突變位點分析 參考擬南芥CAD基因家族的9個基因，從番茄的基因組中去找同源基因。系統(tǒng)進化樹采用Mega 4.0的NJ（neighbor joining）法。直系和旁系同源基因的一致性采用Needle程序（http：//emboss.sourceforge.net/）。突變位點分析主要依據(jù)P31和C285這2份材料的重測序數(shù)據(jù)。

1.2.3 熒光定量分析方法

1.2.3.1 植物總RNA的提取及cDNA的合成 本試驗中通過EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（TaKaRa公司）進行。cDNA的合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒。

1.2.3.2 CAD基因引物設(shè)計 針對CAD基因在2份材料中的突變位點分析，篩選出2個突變位點較多的同源基因Solyc01g107590（CAD590）和Solyc03g078440（CAD440），采用Primer3軟件進行引物設(shè)計，擴增片段長度設(shè)定在180～250 bp，引物長度為20 bp左右，退火溫度為60 ℃，所設(shè)計的引物如表1所示。內(nèi)參基因選用Actin，引物信息（F：5′-CAAACGAGAATTGCCTTGGT-3′，R：5′-CTTAACATCCGCACCAACCT-3′），擴增片段長度為233 bp，退火溫度為60 ℃。

1.2.3.3 熒光定量PCR 以番茄果實cDNA為模板，熒光定量PCR儀選用Roche（Light Cycler 480）。反應體系（20.0 μL）：RNA的反轉(zhuǎn)錄反應液（cDNA溶液）1.6 μL，10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ，0.8 μ正向引物，0.8 μ反向引物，6.8 μL dH2O。反應程序：95 ℃ 30 s;PCR反應40循環(huán)（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）;熔解。試驗設(shè)置3次重復，反應結(jié)束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線。

1.2.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析 采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量;采用Excel 2010和DPS 7.05進行數(shù)據(jù)處理分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同番茄果實發(fā)育過程中木質(zhì)素含量的比較

由圖1可知，番茄感病高代自交系C285果實中木質(zhì)素含量在轉(zhuǎn)色期時達到峰值，紅熟期略有降低，而P31果實中的木質(zhì)素含量在綠熟期、轉(zhuǎn)色期及紅熟期變化較小，綠熟期含量最低、紅熟期最高。

2.2 番茄中CAD基因的預測

在番茄基因組（SL 3.0）及注釋基因的基礎(chǔ)上，針對擬南芥中CAD家族基因，采用BLASTN和BLASTP程序?qū)Ψ阎心举|(zhì)素生物合成基因進行了鑒定。筆者在番茄中共搜索到5個同源基因，分布于番茄染色體1、3、11、12等4條染色體中，

番茄CAD基因與擬南芥相應基因間在蛋白質(zhì)水平上保持 61.5%～73.0%的一致性，平均為66.7%（表2）。

擬南芥中CAD家族成員有9個基因，且功能均已通過驗證，該家族基因也有串聯(lián)重復基因簇出現(xiàn)（CAD6、CAD7和CAD8）。通過序列比對發(fā)現(xiàn)在番茄中存在5個同源基因，同時也有串聯(lián)重復基因簇的出現(xiàn)（Solyc11g011330和Solyc11g011340）。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)（圖2），2個串聯(lián)重復基因簇聚在一個分支，這暗示CAD在擬南芥和番茄中可能經(jīng)歷了相似的進化途徑。Solyc03g078440與CAD9、CAD2及CAD3聚為一簇且與2個串聯(lián)重復基因簇親緣關(guān)系較近;Solyc12g055820與CAD1聚在一起，兩者可能為直系同源基因;Solyc01g107590則與CAD4和CAD5親緣關(guān)系較近。

2.3 不同番茄材料中CAD基因的變異分析

2份材料重測序數(shù)據(jù)（表3）顯示，5個CAD基因中有13個SNP（單核苷酸多態(tài)性）或InDel（插入缺失標記）位點，且絕大多數(shù)突變位點分布在基因間區(qū)或內(nèi)含子區(qū)。Solyc01g107590和Solyc03g078440在2份材料中存在的變異位點較多，分別為4個和5個，突變位點多有可能在基因表達水平產(chǎn)生影響。

2.4 不同番茄果實中CAD基因的表達

2.4.1 不同番茄果實發(fā)育過程中CAD的表達與分析 在果實發(fā)育過程中2番茄CAD基因的相對表達量見圖3，CAD590和CAD440在P31的綠熟期、轉(zhuǎn)色期和紅熟期相對表達量較為穩(wěn)定;而2個基因的表達在C285中則均呈下降趨勢，其中CAD440降幅更大。

2.4.2 不同番茄果實相同發(fā)育階段CAD的表達與分析 木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵基因CAD在2份材料中的相對表達結(jié)果（圖4）顯示，綠熟期CAD590和CAD440在C285中相對表達量與P31相比分別高出約2倍和5倍;轉(zhuǎn)色期P31中CAD590和CAD440則分別高于C285同期的表達量，其增幅分別為130%和170%;就紅熟期而言， 2個基因的相對表達量在P31

材料中差異較小。

3 討論與結(jié)論

本研究以擬南芥中CAD基因家族的9個基因作為參考基因，在番茄中共查詢到5個CAD旁系同源基因，且在核酸水平與擬南芥中同源基因間的一致性為66.7%;5個CAD基因在2份材料中有13個存在突變位點，其中Solyc01g107590和Solyc03g078440在2份材料中存在的變異位點較多。番茄抗病材料P31和感病材料C285的果實中木質(zhì)素含量在不同生育階段均有差異，感病材料C285中木質(zhì)素含量在轉(zhuǎn)色期時達到峰值，紅熟期略有降低;抗病材料P31中的木質(zhì)素含量在3個時期變化較小，綠熟期含量最低、紅熟期最高。說明抗病材料P31在番茄生長過程中，CAD基因表達正常，木質(zhì)素含量相對穩(wěn)定，而感病材料C285在每個時期其木質(zhì)素含量不如抗病材料P31穩(wěn)定，CAD基因存在變異所致，這與已有研究結(jié)果[8-9]一致。

本研究結(jié)果表明，CAD590和CAD440在P31的綠熟期和轉(zhuǎn)色期相對表達量較為穩(wěn)定，在紅熟期則大幅升高;而2個基因的表達在C285中則均呈下降趨勢，其中CAD440降幅更大。綠熟期CAD590和CAD440在感病材料C285中相對表達量與P31相比分別高出2倍和5倍，轉(zhuǎn)色期也分別提高了130%和170%，而紅熟期2個基因的相對表達量在2份材料中差別較小。同一基因在不同材料中同一時期表達不同，不同基因在同一材料同一時期也不盡相同，這與朱金鑫等的研究結(jié)果[10-11]一致。

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收稿日期：2017-10-27

基金項目：山東省自然科學基金（編號：ZR2014CQ034）;山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：SDAIT-05-02）;青島農(nóng)業(yè)大學高層次人才科研基金（編號：663-1115041）;山東省農(nóng)業(yè)良種工程。

作者簡介：李 芬（1993—），女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向為蔬菜遺傳育種與分子生物學。E-mail：15192642252@163.com。

通信作者：王 富，博士，教授，研究方向為番茄遺傳育種及生物技術(shù)。E-mail：wangfuabcd@163.com。