王鵬 郭文英 王文靜

摘要：以苦皮藤嫩莖、腋芽、幼嫩葉、成熟葉為材料，開展苦皮藤愈傷組織誘導(dǎo)體系建立研究。結(jié)果表明：（1）2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）有利于嫩莖、腋芽和幼嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)，且隨著濃度的升高（0.5 mg/L→2.0 mg/L）誘導(dǎo)率逐漸增大，濃度為MS+2.0 mg/L 2，4-D的激素組合能使嫩莖、腋芽和幼嫩葉產(chǎn)生最大的愈傷組織誘導(dǎo)率，分別為46.5%、66.6%、20.5%。（2）一定濃度水平的萘乙酸（NAA）和激動(dòng)素（KT）組合，有利于腋芽和幼嫩葉愈傷組織的形成，誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生愈傷組織的最佳激素組合為MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT，誘導(dǎo)率為15.5%;誘導(dǎo)幼嫩葉產(chǎn)生愈傷組織的最佳激素組合為MS+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，誘導(dǎo)率為18.5%。（3）幼嫩的外植體（嫩莖、嫩葉）較成熟的外植體（嫩莖下端枝條、成熟葉）容易產(chǎn)生愈傷組織。（4）在嫩莖和腋芽作為外植體時(shí)，a培養(yǎng)較b培養(yǎng)對(duì)外植體的誘導(dǎo)率要高;當(dāng)葉片作為外植體時(shí)，b培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率要大于a培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：苦皮藤;愈傷組織誘導(dǎo);激素組合;誘導(dǎo)率

中圖分類號(hào)： Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0092-04

苦皮藤（Celastrus angulatus Max.）是衛(wèi)矛科（Celastraceae）南蛇藤屬（Celastrus）植物，主要分布在我國黃河流域和長(zhǎng)江流域[1]。據(jù)筆者調(diào)查，苦皮藤在河南伏牛山區(qū)海拔800 m左右的灌木叢中廣泛分布，在海拔超過2 000 m的深山也有分布?？嗥ぬ僮怨乓詠碓谖覈耖g就已被使用，利用其根皮經(jīng)陰干磨制成粉末，用少許施于蔬菜葉面或菜心防治蔬菜害蟲，效果明顯。據(jù)吳文君研究，苦皮藤根皮和葉中含有殺蟲的活性物質(zhì)，其活性成分主要是一大類具有β-二氫沉香呋喃骨架的倍半萜多元醇酯類化合物[2]。這種活性成分對(duì)昆蟲具有拒食、麻醉、毒殺的作用。由于這種活性成分來源于植物苦皮藤，能夠快速降解，對(duì)人畜低毒[3]，不污染環(huán)境，是無公害蔬菜理想的殺蟲藥物。但是，傳統(tǒng)的使用方法要采挖大量的苦皮藤樹根，未免造成植被破壞、水土流失，破壞生態(tài)環(huán)境。利用植物組織培養(yǎng)的方法，從愈傷組織合成的次生代謝產(chǎn)物中進(jìn)行提取和應(yīng)用，國內(nèi)外皆有成功的案例報(bào)道[4-12]，但從苦皮藤植物組織培養(yǎng)的愈傷組織中提取β-二氫沉香呋喃骨架的倍半萜多元醇酯類化合物鮮有報(bào)道。因此，利用苦皮藤植物組織培養(yǎng)的方法，開展對(duì)苦皮藤愈傷組織誘導(dǎo)研究，為苦皮藤活性成分提取的工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，對(duì)開發(fā)利用苦皮藤植物資源具有現(xiàn)實(shí)和深遠(yuǎn)的意義[12]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦皮藤嫩莖、腋芽、幼嫩葉、成熟葉（枝條下部葉片）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基制作 以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同濃度的萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、激動(dòng)素（KT）和6-芐氨基嘌呤（6-BA），作為不同的處理：

A1-1：MS+0.2 mg/L NAA，A1-2：MS+0.5 mg/L NAA，A1-3：MS+1.0 mg/L NAA;

B1-1：MS+0.5 mg/L 2，4-D，B1-2：MS+1.0 mg/L 2，4-D，B1-3：MS+2.0 mg/L 2，4-D;

C1-1：MS+0.2 mg/L KT， C1-2：MS+0.5 mg/L KT，C1-3：MS+1.0 mg/L KT;

D1-1：MS+0.5 mg/L 6-BA，D1-2：MS+1.0 mg/L 6-BA，D1-3：MS+2.0 mg/L 6-BA;

E1-1：MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，E1-2：MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT，E1-3：MS+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

1.2.2 材料處理 5月中旬從大田取回正在生長(zhǎng)中的1年生枝條，用濕毛巾包裹帶回實(shí)驗(yàn)室。將帶葉片的枝條用流水沖洗干凈，做以下處理：（1）將嫩莖部分剪切成5 cm長(zhǎng)的莖段，放入裝有少量蒸餾水的燒杯中待用（編號(hào)為Ⅰ號(hào)燒杯）;（2）將枝條的腋芽用鋒利的小刀取下，放入盛有少量蒸餾水的燒杯中待用（編號(hào)為Ⅱ號(hào)燒杯）;（3）將枝條頂部的幼嫩葉帶葉柄剪下，放入盛有少量蒸餾水的燒杯中待用（編號(hào)為Ⅲ號(hào)燒杯）;（4）將枝條下部的葉（成熟葉）帶葉柄剪下，放入盛有少量蒸餾水的燒杯中待用（編號(hào)為Ⅳ號(hào)燒杯）。

1.2.3 材料滅菌 在超凈工作臺(tái)中將Ⅰ號(hào)燒杯中的莖段放入裝有70%乙醇的燒杯中，滅菌10 s，取出用無菌水沖洗3次，每次20～30 s;再將莖段放入裝有0.1% HgCl2的燒杯中浸泡 10 min，每2 min用玻璃棒攪拌1次;0.1% HgCl2滅菌后，用無菌水沖洗3次，每次20～30 s;沖洗后用無菌濾紙吸干水分，放入無菌培養(yǎng)皿中待用。

Ⅱ號(hào)燒杯中的腋芽滅菌與上述方法相同;Ⅲ號(hào)燒杯中的幼嫩葉和Ⅳ號(hào)燒杯中的成熟葉用70%乙醇滅菌5 s，其他均按照上述方法滅菌處理。

1.2.4 接種 嫩莖接種：在無菌培養(yǎng)皿中，將滅菌的嫩莖段用手術(shù)刀切去兩端長(zhǎng)1～2 mm部分（切去因滅菌造成傷害的部分），剩余部分切成長(zhǎng)4～5 mm的莖段（均不帶腋芽，腋芽另做處理）。用鑷子將切好的莖段輕輕插入培養(yǎng)基（A1-1、A1-2、…、E1-2、E1-3）中，深約2 mm，蓋好瓶蓋。每個(gè)處理接種20瓶。

腋芽接種：用鑷子將滅菌的腋芽輕輕剝?nèi)パ亏[，去掉帶有的少量木質(zhì)部，芽眼朝上接種于培養(yǎng)基（A1-1、A1-2、…、E1-2、E1-3）的表面。每個(gè)處理接種20瓶。

幼嫩葉的接種：將消過毒的嫩葉在培養(yǎng)皿中用剪刀剪成0.5 cm×0.5 cm左右的小葉片，接種于培養(yǎng)基（A1-1、A1-2、…、E1-2、E1-3）的表面;每個(gè)處理接種20瓶。

成熟葉片接種：在培養(yǎng)皿中將滅菌的葉片用剪刀剪成 0.5 cm×0.5 cm左右的小葉片，接種于培養(yǎng)基（A1-1、A1-2、…、E1-2、E1-3）的表面。每個(gè)處理接種20瓶。

1.2.5 培養(yǎng) 采用a培養(yǎng)和b培養(yǎng)2種培養(yǎng)方法。a培養(yǎng)：按種后，將幼嫩莖、腋芽、幼嫩葉、成熟葉4種器官的不同處理各拿出10瓶，放入人工智能氣候培養(yǎng)箱中，1 d內(nèi)設(shè)置不同時(shí)段的培養(yǎng)時(shí)間、光照度、溫度、濕度進(jìn)行培養(yǎng)：2 h、500 lx、18 ℃、85%;2 h、1 000 lx、20 ℃、85%;8 h、1 500 lx、25 ℃、85%;2 h、1 000 lx、20 ℃、85%;2 h、500 lx、18 ℃、85%;8 h、0 lx、15 ℃、85%。每天如此循環(huán)。

b培養(yǎng)：將各處理剩下的10瓶直接放在培養(yǎng)架上，采用自然氣候培養(yǎng)。待有愈傷組織生成后再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 d 內(nèi)設(shè)置不同時(shí)段的培養(yǎng)時(shí)間、光照度、溫度、濕度：2 h、500 lx、18 ℃、85%;2 h、1 000 lx、20 ℃、85%;8 h、1 500 lx、25 ℃、85%;2 h、1 000 lx、20 ℃、85%;2 h、500 lx、18 ℃、85%;8 h、0 lx、15 ℃、85%。每天如此循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦皮藤嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)

在培養(yǎng)7 d后調(diào)查a培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有3/10的莖段出現(xiàn)不同程度的褐化現(xiàn)象，為了避免褐化程度加重，將所有處理的莖段轉(zhuǎn)接到與之相同處理的新培養(yǎng)基中。經(jīng)過15 d的培養(yǎng)，還有3/10的莖段有褐化現(xiàn)象產(chǎn)生，為防止褐化的發(fā)展，再次將所有莖段轉(zhuǎn)接到與之相同處理的新的培養(yǎng)基中，以后個(gè)別發(fā)生褐化，按照同樣的方法轉(zhuǎn)接。經(jīng)30、45、60 d誘導(dǎo)培養(yǎng)后，調(diào)查結(jié)果如表1所示。

b培養(yǎng)在前7 d沒有發(fā)現(xiàn)褐化，15 d時(shí)有2/10瓶產(chǎn)生褐化，為防止褐化的發(fā)展，按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)接。經(jīng)30、45、60 d誘導(dǎo)培養(yǎng)后，調(diào)查結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，A1-1、C1-1、C1-2、C1-3、D1-1、D1-2、D1-3、E1-1 8種處理在30～60 d的a、b 2種培養(yǎng)中都沒有愈傷組織生成。A1-2、A1-3、E1-2、E1-3 4種處理在a培養(yǎng) 60 d 時(shí)才有少部分莖段生成愈傷組織，誘導(dǎo)率分別為1.2%、12%、2.5%、4.8%，生成愈傷組織的部位均在莖的頂端;在b培養(yǎng)中，A1-2、A1-3、E1-2、E1-3 4種處理只有E1-3在培養(yǎng) 60 d 后有少量愈傷組織生成，誘導(dǎo)率為1.4%，A1-2、A1-3、E1-2 3種處理均無愈傷組織產(chǎn)生。

從表1還可以看出，產(chǎn)生愈傷組織效果比較明顯的是B1-1、B1-2、B1-3處理。處理B1-1在a培養(yǎng)45 d時(shí)有少量愈傷組織生成，60 d時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)到4.8%，但在b培養(yǎng)中60 d時(shí)誘導(dǎo)率只有2.2%;B1-2、B1-3處理在a培養(yǎng)的15 d就有少量愈傷組織生成，30 d時(shí)分別達(dá)到2.2%、6.4%，45 d時(shí)誘導(dǎo)率分別達(dá)到8.6%、14.5%，60 d時(shí)誘導(dǎo)率分別達(dá)24.5%、46.5%;但在b培養(yǎng)中，B1-1處理在60 d時(shí)誘導(dǎo)率只有2.2%，B1-2、B1-3處理45 d時(shí)誘導(dǎo)率分別達(dá)到4.4%、5.2%，60 d時(shí)分別達(dá) 7.6%、12.5%。

注：誘導(dǎo)率為生成愈傷組織器官個(gè)數(shù)占該處理接種器官個(gè)數(shù)的百分比;處理A1-1、C1-1、C1-2、C1-3、D1-1、D1-2、D1-3、E1-1因60 d內(nèi)a培養(yǎng)、b培養(yǎng)2種培養(yǎng)方法均沒有誘導(dǎo)出愈傷組織而在表中省略。以下凡是在60 d調(diào)查時(shí)無愈傷組織生成的均省略。

綜上所述，可得出如下結(jié)論：（1）低濃度的NAA不能誘導(dǎo)嫩莖愈傷組織產(chǎn)生，隨著NAA濃度的升高有少量愈傷組織被誘導(dǎo);0.2～1.0 mg/L KT、0.5～2.0 mg/L 6-BA和 0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT組合均不能誘導(dǎo)嫩莖愈傷組織生成;2，4-D有利于嫩莖愈傷組織的誘導(dǎo)，且隨著濃度的升高誘導(dǎo)率逐漸增大;（2）產(chǎn)生愈傷組織的部位均在嫩莖的頂端，發(fā)生褐化的嫩莖則無愈傷組織生成;（3）a培養(yǎng)較b培養(yǎng)容易產(chǎn)生愈傷組織。

2.2 苦皮藤腋芽愈傷組織誘導(dǎo)

腋芽培養(yǎng)7 d時(shí)進(jìn)行觀察，少部分帶有皮層的腋芽的周圍培養(yǎng)基有變褐的現(xiàn)象，為了防止褐化的蔓延，及時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)接，并切除皮層部分。經(jīng)過30、45、60 d的培養(yǎng)，結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，a培養(yǎng)在培養(yǎng)30 d時(shí)，B1-2和B1-3處理有愈傷組織生成，誘導(dǎo)率分別為12.5%、18.0%;培養(yǎng)45 d時(shí)，處理A1-2、A1-3、B1-1、B1-2、B1-3、E1-2、E1-3均有愈傷組織生成，B1-2、B1-3處理誘導(dǎo)率較高，分別為22.4%、36.1%;當(dāng)培養(yǎng)到60 d時(shí)，除C1-1、D1-1、D1-2、D1-3處理仍沒有愈傷組織產(chǎn)生外，其他處理均有愈傷組織產(chǎn)生，以處理B1-3誘導(dǎo)率最高，為66.6%，處理B1-2次之，為41.8%，其次是E1-2、E1-3、B1-1、A1-2、A1-3，誘導(dǎo)率分別為15.5%、14.6%、14.5%、12.4%、11.8%。結(jié)果表明，a培養(yǎng)中，B1-3激素水平MS+2.0 mg/L 2，4-D最有利于愈傷組織形成，其次是B1-2的 MS+1.0 mg/L 2，4-D的激素水平。

在b培養(yǎng)中，除了C1-1、C1-2、C1-3、D1-1、D1-2、D1-3處理在培養(yǎng)60 d時(shí)仍沒有愈傷組織生成外， 其他處理均有愈傷組織生成，其中B1-2、B1-3處理效果較佳，在誘導(dǎo)30 d時(shí)就分別有6.5%、7.2%的愈傷組織生成，60 d時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率分別達(dá)22.5%、29.8%。其次是A1-2、A1-3、B1-1、E1-2、E1-3處理，在培養(yǎng)45 d時(shí)都有不同比例的愈傷組織生成，在培養(yǎng)60 d時(shí)以E1-2、E1-3、B1-1處理的誘導(dǎo)率較高，分別為 11.5%、10.0%、9.5%。結(jié)果表明，b培養(yǎng)中，B1-2、B1-3處理的激素組合有利于腋芽愈傷組織的產(chǎn)生，但誘導(dǎo)率低于a培養(yǎng)。

通過對(duì)沒有產(chǎn)生愈傷組織的腋芽的觀察發(fā)現(xiàn)，大部分腋芽都有膨大的現(xiàn)象。對(duì)膨大的芽和產(chǎn)生愈傷組織的芽的解剖來看，膨大的芽芽鱗光亮、圓渾，芽?jī)?nèi)的幼葉發(fā)生皺褶和肥厚，生長(zhǎng)點(diǎn)增厚;產(chǎn)生愈傷組織的芽起初也是芽鱗先膨大，愈傷組織產(chǎn)生的位置是幼葉的邊緣，生長(zhǎng)點(diǎn)處只是出現(xiàn)不規(guī)則的增厚。

2.3 苦皮藤幼嫩葉片愈傷組織誘導(dǎo)

當(dāng)把嫩葉接入培養(yǎng)基后，a培養(yǎng)3 d就有葉片開始發(fā)褐，7 d 已經(jīng)有2/10的葉片邊緣發(fā)生淺褐色，部分葉片周圍的培養(yǎng)基變?yōu)楹稚?。將有培養(yǎng)基變?yōu)楹稚娜~片轉(zhuǎn)接到同樣處理的新培養(yǎng)基中，以防褐化繼續(xù)蔓延。b培養(yǎng)中，到培養(yǎng)15 d時(shí)有1/10的葉片逐漸變褐，也將有葉片周圍培養(yǎng)基變?yōu)楹稚娜~片轉(zhuǎn)接到同樣處理的新的培養(yǎng)基中。以后遇到同樣的情況，均照此方法處理，減少褐化的發(fā)生。經(jīng)過30、45、60 d的觀察，結(jié)果如表3所示。

所有葉片在培養(yǎng)到30 d時(shí)，均沒有愈傷組織生成。30 d后只有個(gè)別處理才陸續(xù)生成愈傷組織，且產(chǎn)生愈傷組織的部位少部分在皺縮增厚的葉片邊緣，大部分在葉片的主脈位置。從表3可以看出，在培養(yǎng)到45 d時(shí)，2種培養(yǎng)方法的B1-2、B1-3、E1-2、E1-3 4個(gè)處理均有愈傷組織生成，a培養(yǎng)的B1-2、B1-3、E1-2、E1-3處理的誘導(dǎo)率分別為5.2%、8.8%、4.5%、8.4%，相比之下，B1-3處理和E1-3處理的誘導(dǎo)率高于其他2個(gè)處理;b培養(yǎng)在45 d觀察時(shí)，B1-2、B1-3、E1-2、E1-3處理的誘導(dǎo)率分別為12.6%、18.9%、12.5%、13.8%，相比之下B1-3處理的誘導(dǎo)率最高。在培養(yǎng)到60 d時(shí)，a培養(yǎng)的B1-2、B1-3、E1-2、E1-3處理的誘導(dǎo)率分別為8.4%、12.2%、5.6%、10.4%，4種處理在b培養(yǎng)的條件下誘導(dǎo)率分別為14.2%、20.5%、16.2%、18.5%，相比之下b培養(yǎng)的B1-3處理誘導(dǎo)率最高。綜上所述，B1-3的激素組合（2.0 mg/L 2，4-D）與E1-3的激素組合（1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT）均有利于嫩葉愈傷組織的形成;在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，b培養(yǎng)的誘導(dǎo)率總是大于a培養(yǎng)的誘導(dǎo)率，可能原因是a培養(yǎng)的光照度大于b培養(yǎng)，在培養(yǎng)前期光照度越大，越不利于愈傷組織的生成;即使最佳激素組合愈傷組織的誘導(dǎo)率也不高（最高為20.5%），這可能與大部分葉片愈傷組織形成的部位只在中脈處有關(guān)。

2.4 苦皮藤成熟葉愈傷組織誘導(dǎo)

當(dāng)把成熟葉接入培養(yǎng)基后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)3 d就開始有葉片變褐，由葉片的邊緣逐漸向內(nèi)部延伸，采用轉(zhuǎn)接的方法盡量減緩褐化的進(jìn)度。經(jīng)30、45、60 d培養(yǎng)，不同處理和不同的培養(yǎng)方法對(duì)成熟葉愈傷組織的影響情況如表4所示。

由表4可以看出，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)只有B1-2、B1-3、E1-2、E1-3 4個(gè)處理才有，且在30 d前沒有任何愈傷組織產(chǎn)生。在45 d觀察時(shí)，不同處理在a、b 2種培養(yǎng)條件下的誘導(dǎo)率明顯不同，B1-2處理的誘導(dǎo)率分別為2.5%、4.3%，B1-3處理的誘導(dǎo)率分別為3.2%、6.6%，E1-2和E1-3處理的誘導(dǎo)率分別為1.2%、2.5%和2.6%、4.8%，顯而易見，b培養(yǎng)的誘導(dǎo)率要大于a培養(yǎng)。在60 d觀察時(shí)，不同處理在a、b 2種培養(yǎng)條件下的誘導(dǎo)率也不同，b培養(yǎng)的誘導(dǎo)率大于a培養(yǎng)。結(jié)果表明：（1）對(duì)成熟葉的誘導(dǎo)，前期培養(yǎng)光照度和溫度的不同，會(huì)影響到誘導(dǎo)率，光照度過大、溫度過高會(huì)降低葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率;（2）愈傷組織產(chǎn)生的時(shí)間都在30 d后，產(chǎn)生的部位為葉的中脈位置，開始時(shí)生成白色的愈傷組織顆粒，后逐漸加大;（3）成熟葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率小于幼嫩葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率。

觀察中發(fā)現(xiàn)，30 d時(shí)，有的葉片從外觀上看已經(jīng)呈現(xiàn)褐色，但到45 d觀察時(shí)又在葉脈處產(chǎn)生了愈傷組織，45 d觀察時(shí)依然沒有產(chǎn)生愈傷組織的變褐葉片，在60 d觀察時(shí)居然又在葉脈處生成了愈傷組織，說明葉片呈現(xiàn)褐色不代表葉片中脈的細(xì)胞死亡，因此要耐心等待。

3 討論與結(jié)論

外植體不同，產(chǎn)生愈傷組織的能力和部位不同。幼嫩的外植體（嫩莖、嫩葉）較成熟的外植體（嫩莖下端枝條、成熟葉）容易產(chǎn)生愈傷組織。腋芽（最高66.6%）較嫩莖（最高46.5%）對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率要高。葉片產(chǎn)生愈傷組織的部位大部分在葉的中脈和中脈兩側(cè)位置，嫩莖產(chǎn)生愈傷組織的部位在莖的頂端。這種現(xiàn)象除了與外植體內(nèi)外激素有關(guān)外，還可能與器官的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)有關(guān)。根據(jù)植物莖器官的結(jié)構(gòu)，在木質(zhì)部和韌皮部之間的形成層細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力[13]，因此靠近嫩莖頂端的組織因分化程度低極易產(chǎn)生愈傷組織。葉脈的主脈結(jié)構(gòu)也是由木質(zhì)部和韌皮部組成[14]，形成層細(xì)胞也具有較強(qiáng)的活力，也是容易生成愈傷組織的部位。芽是由幼葉、葉原基和生長(zhǎng)點(diǎn)組成，從結(jié)構(gòu)組成來看還處于原生結(jié)構(gòu)和初生結(jié)構(gòu)階段，其細(xì)胞也具有較強(qiáng)的分裂能力[15]，也是易形成愈傷組織的部位。對(duì)于成熟的器官來說，活細(xì)胞在激素的誘導(dǎo)下才能脫分化恢復(fù)分裂能力，因此要形成愈傷組織需要經(jīng)過誘導(dǎo)期、分裂期這樣一個(gè)過程[16]。

培養(yǎng)條件不同，產(chǎn)生愈傷組織的能力不同。在嫩莖和腋芽作為外植體時(shí)，a培養(yǎng)較b培養(yǎng)對(duì)外植體的誘導(dǎo)率要高。當(dāng)葉片作為外植體時(shí)，b培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率要大于a培養(yǎng)。培養(yǎng)條件除了激素水平外，還有溫度、光照度、濕度等因素[17]。a培養(yǎng)是在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度、光照度、濕度的大小和時(shí)間是人工設(shè)置的，有固定的規(guī)律性變化，這種條件使組織結(jié)構(gòu)比較完整、保護(hù)組織比較發(fā)達(dá)的嫩莖和腋芽容易產(chǎn)生愈傷組織。b培養(yǎng)前期的培養(yǎng)溫度、光照度、濕度沒有相對(duì)規(guī)律性的變化，尤其是室內(nèi)光照度在0～550 lx之間，濕度更低。從比較分析來看，強(qiáng)光照比弱光照容易使組織褐化，不利于愈傷組織的誘導(dǎo)[18]。葉的組織結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，保護(hù)組織不夠發(fā)達(dá)，對(duì)光照敏感，較強(qiáng)的光照易使其褐化[18]。因此，a培養(yǎng)較b培養(yǎng)容易使嫩莖和腋芽產(chǎn)生愈傷組織;b培養(yǎng)較a培養(yǎng)容易使葉片產(chǎn)生愈傷組織。

不同的激素水平，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)差異明顯[19-20]。研究表明，生長(zhǎng)素2，4-D在多數(shù)情況下都能成功地誘導(dǎo)愈傷組織[21]，在本試驗(yàn)中，2，4-D有利于嫩莖和腋芽愈傷組織的誘導(dǎo)，且隨著濃度的升高誘導(dǎo)率逐漸增大，最大誘導(dǎo)率濃度為MS+2.0 mg/L 2，4-D;如果2，4-D的濃度大于2.0 mg/L，是否還能增大誘導(dǎo)率，有待于下一步的研究。NAA作為常用的生長(zhǎng)素，如果像2，4-D一樣單獨(dú)使用，不能誘導(dǎo)出葉的愈傷組織，在嫩莖和腋芽作為外植體時(shí)，只有部分能夠誘導(dǎo)出愈傷組織，這與對(duì)小麥胚的愈傷組織誘導(dǎo)的研究結(jié)果[22]相吻合。KT和6-BA都是常用的細(xì)胞分裂素，但兩者單獨(dú)使用也不能誘導(dǎo)出愈傷組織（處理C：MS+0.2→1.0 mg/L KT，處理D：MS+0.5→2.0 mg/L 6-BA），無論是嫩莖、腋芽還是葉都是這樣。試驗(yàn)表明，一定濃度水平的NAA和KT組合，有利于腋芽愈傷組織的形成，本試驗(yàn)的最佳激素組合和水平是MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT。有利于誘導(dǎo)葉產(chǎn)生愈傷組織的最佳激素組合和水平是MS+2.0 mg/L 2，4-D和 MS+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。參考文獻(xiàn)：

[1]中國科學(xué)院《中國植物志》編輯委員會(huì).中國植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，2004.

[2]吳文君. 植物殺蟲劑苦皮藤素研究與應(yīng)用[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2011.

[3]Yin W P，Zhao T Z，F(xiàn)u J G. Chinese bittersweet alkaloid Ⅲ，a new compound from Celastrus angulatus[J]. Journal of Asian Natural Products Research，2001，3（3）：183-189.

[4]李 琰，馮俊濤，王永宏，等. 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對(duì)雷公藤愈傷組織生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物含量的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)，2010，46（5）：64-69.

[5]唐建軍，項(xiàng)田夫，張祿源，等. 植物次生代謝、離體培養(yǎng)條件下次生代謝物積累及其調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 中國野生植物資源，1998，17（4）：1-6.

[6]孔祥海. 植物次生代謝物的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 龍巖學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，23（6）：60-63，76.

[7]呂春茂，范海延，姜 河，等. 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)合成次生代謝物質(zhì)研究進(jìn)展[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，22（1）：1-7.

[8]谷榮輝，洪利亞，龍春林. 植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的途徑[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2013，49（9）：869-881.

[9]劉進(jìn)平，吳佳靜，黃艷麗，等. 海南粗榧外植體滅菌與愈傷組織誘導(dǎo)[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技，2010，33（1）：39-41.

[10]謝植干. 殺蟲植物鴉膽子組織培養(yǎng)和生物活性的初步研究[D]. 南寧：廣西大學(xué)，2008.

[11]白雪芳，王靖楣，卜宗式，等. 三尖杉懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)及抗癌生物堿的產(chǎn)生[J]. 中國生化藥物雜志，1999，20（3）：139-142.

[12]王 鵬，王文靜，黃 杰. 苦皮藤植物組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀與前景展望[J]. 現(xiàn)代牧業(yè)，2017，1（4）：33-38.

[13]錢 雪. 2種丁香屬植物營養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)及生理指標(biāo)研究[D]. 長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[14]謝兆森，杜鴻儒，李建寶，等. 組織透明法觀察葡萄葉片生長(zhǎng)過程中氣孔與葉脈形態(tài)結(jié)構(gòu)特征變化[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2018，54（2）：237-246.

[15]張俊苗，李文勝，史 進(jìn). 短枝條紅型“紅富士”蘋果芽變的葉片解剖結(jié)構(gòu)及其抗旱性研究[J]. 北方園藝，2016（18）：22-25.

[16]吳麗芳，魏曉梅，應(yīng)倩倩，等. 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)白刺花葉片愈傷組織誘導(dǎo)質(zhì)量分析[J]. 北方園藝，2018，409（10）：63-69.

[17]過 聰，張慶華，向發(fā)云，等. 非洲菊嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)和增殖因素研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，56（23）：4545-4548.

[18]呂永平，陳 志，李坤峰，等. 光照環(huán)境對(duì)大花月季組織培養(yǎng)的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29（8）：1297-1304.

[19]賈 茸，朱永平，江 周，等. 洋桔梗小孢子培養(yǎng)胚性愈傷組織誘導(dǎo)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（14）：39-42.

[20]劉義存，黃天啟，林順權(quán). 枇杷屬若干野生種葉片愈傷組織誘導(dǎo)和再分化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（5）：32-35.

[21]李俊明，朱登云. 植物組織培養(yǎng)教程[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2005.

[22]王晶晶. 小麥幼胚及成熟胚愈傷組織分化和繼代分化的影響因素研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

收稿日期：2018-09-08

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：172102110040）。

作者簡(jiǎn)介：王 鵬（1967—），男，河南南召人，碩士，副教授，主要從事園林植物栽培與養(yǎng)護(hù)、植物與植物生理教學(xué)與科研工作。E-mail：zzmz_w@126.com。

通信作者：王文靜，碩士，教授，主要從事生物化學(xué)、植物生理的教學(xué)與科研工作。E-mail：wwj70@126.com。