姚思揚 趙春莉 劉子平 劉翰升 劉玥

摘要：為了研究優(yōu)化紅顏草莓繼代增殖培養(yǎng)的條件，以草莓品種紅顏繼代組培苗為試驗材料，利用響應面法對其增殖條件進行優(yōu)化。在單因素的試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以瓊脂濃度、光照度、pH值為試驗因子，以增殖系數(shù)為響應值，進行3因素3水平的試驗設計。結果表明：3因素對植株增殖系數(shù)的影響力大小為光照度>pH值>瓊脂濃度，最終得到的二元回歸方程顯示，紅顏草莓增殖條件的優(yōu)化結果如下：瓊脂濃度為 7.1 g/L，pH值為5.37，光照度為2 177 lx。在此條件下，最佳增殖系數(shù)預測值為10.930 5，實際操作結果為10.73。

關鍵詞：草莓品種;離體繁殖;增殖條件;響應面法

中圖分類號： S668.404+.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0088-04

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是薔薇科草莓屬多年生草本植物，紅顏（Benihoppe）為著名的日本品種，是以幸香和章姬為親本雜交選育而來的，其果實鮮紅飽滿，味道香甜可口，產量高，耐儲存耐運輸[1]，深受廣大種植者和消費者的喜愛，具有較高的經濟價值，擁有廣闊的市場。草莓的傳統(tǒng)繁殖方法是匍匐莖繁殖和分枝繁殖，效率低，易感染病毒，長久的病毒累積使品種退化，產量降低[2]。經過莖尖脫毒培養(yǎng)后進行離體快繁，不受季節(jié)限制，產量高，培養(yǎng)周期短，是獲得大量無病毒原種苗的有效手段。

目前，關于草莓組培的相關研究，大部分集中于探討培養(yǎng)基內激素的種類及濃度，旨在篩選出每個階段的最佳培養(yǎng)基[3-7]，但關于其他培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究鮮有報道。本試驗旨在探討增殖階段，pH值、光照度、瓊脂濃度對其增殖率的影響。并在單因素的試驗基礎上，參考Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，用響應面法將各因子的相互關系進行擬合分析，研究各因子與響應值的關系，從而優(yōu)化紅顏草莓的組培條件，以期為今后相關研究提供理論實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為吉林農業(yè)大學溫室的當年生草莓匍匐莖尖，于2017年5月采摘，在園藝學院園林生物技術實驗室內經初代培養(yǎng)后，選取長勢一致的、高2 cm左右的紅顏草莓繼代組培苗為試驗材料。在預試驗的基礎上，所用的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，蔗糖濃度30 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

1.2.1.1 pH值對增殖系數(shù)的影響 將不定芽接種到培養(yǎng)基內，光照度為2 000 lx，光照時間為14 h/d，培養(yǎng)室溫度為 （25±2） ℃，pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，瓊脂粉濃度為 7 g/L。每個水平處理10個組培苗，培養(yǎng)周期為30 d。

1.2.1.2 光照度對增殖系數(shù)的影響 將不定芽接種到培養(yǎng)基內，pH值為6.0，光照時間為14 h/d，培養(yǎng)室溫度為（25±2） ℃，光照度為1 200、1 500、1 800、2 100、2 400 lx。瓊脂粉濃度為7 g/L，每個水平處理10個組培苗，培養(yǎng)周期為30 d。

1.2.1.3 瓊脂濃度對增殖系數(shù)的影響 將不定芽接種到培養(yǎng)基內，pH值為6.0，光照時間為14 h/d，光照度為2 000 lx，培養(yǎng)室溫度為（25±2） ℃，瓊脂濃度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 g/L，每個水平處理10個組培苗，培養(yǎng)周期為30 d。

1.2.2 響應面優(yōu)化試驗 在單因素試驗的基礎上，用響應面分析法，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以pH值、光照度、瓊脂濃度為試驗因子，增殖系數(shù)為響應值，進行3因素3水平的試驗設計，見表1。每個水平處理10個組培苗，培養(yǎng)周期為30 d。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS和Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析。增殖系數(shù)=培養(yǎng)30 d后不定芽總數(shù)/接種的不定芽數(shù)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 pH值對增殖系數(shù)的影響 由表2可知，pH值為5.5時，試管苗呈翠綠色，植株健壯，與其他大部分處理間差異顯著。當pH值為6.0時，增殖系數(shù)隨著pH值的繼續(xù)升高而降低。當pH值為7.0時，培養(yǎng)基內環(huán)境為堿性，增殖系數(shù)只有3.30，植株矮小，長勢不佳。由此可見，草莓增殖階段更適于酸性的培養(yǎng)環(huán)境，堿性環(huán)境會抑制其增殖與生長，增殖培養(yǎng)的最適pH值為5.5，增殖系數(shù)可達5.90。

2.1.2 光照度對增殖系數(shù)的影響 由表2可知，增殖系數(shù)隨光照度的增大呈先上升后下降的趨勢，在光照度 1 200 lx 下，試管苗生長緩慢，長勢不佳，增殖率只有3.1。隨著光照度的增加，植株長勢隨之變好，增殖系數(shù)隨之增加，但光照度為2 400 lx時，增殖系數(shù)下降，且試管苗失綠變透明狀，有玻璃化現(xiàn)象。由此可見，光照度過低會抑制植株生長，過高會產生玻璃化苗，不利于植株生長，增殖培養(yǎng)的最佳光照度為 2 100 lx，增殖系數(shù)為6.90。

2.1.3 瓊脂濃度對增殖系數(shù)的影響 由表2可知，瓊脂濃度低于7.0 g/L時，增殖系數(shù)都低于5，植株矮小且有玻璃化苗產生。當瓊脂濃度≥7.0 g/L時，植株生長健壯，無玻璃化苗。C4、C5這2處理差異不顯著，都有很好的增殖效果，且植株長勢極佳，但從經濟成本上考慮，篩選出最適宜增殖培養(yǎng)的瓊脂濃度為7.5 g/L，增殖系數(shù)為6.50。

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

2.2.1 二元模型的建立與分析 以增殖系數(shù)（Y）為響應值，瓊脂濃度（X1）、pH（X2）、光照度（X3）為因素，經過Design-Expert 8.0.6軟件分析，得出的回歸方程模型為Y=10.66+0.36X1-0.89X2+1.00X3+0.33X1X2+0.050X1X3+020X2X3-0.89X21-1.54X22-1.87X23。該回歸模型P為 0.000 3<0.01，有極顯著差異，失擬項為0.174 6>0.05，差異不顯著，模型穩(wěn)定性較好。該方程響應面試驗設計與結果見表3。R2=0.962 6，說明方程擬合性良好，試驗誤差小。由表4可知，X1對響應值影響不顯著，X2、X3影響極顯著，3因素對增殖系數(shù)的影響力大小為X3>X2>X1，X1、X2、X3的二次項都對響應值有極顯著影響，交互作用影響均不顯著。

2.2.2 響應面分析 根據(jù)擬合方程，繪制3因素之間交互作用的響應面圖和等高線圖，各圖表示在1種因素取值為0時，其他2種因素對響應值的影響。響應面曲面的陡峭程度可表明因素對響應值的影響力大小，曲面越陡，影響力越大，反之則越小。由等高線的形狀可知交互效應的強弱，橢圓形表明效應顯著，圓形則相反[8]。由圖1、圖2、圖3可知，有關瓊脂濃度的曲面較平緩，可見瓊脂的影響力小。關于光照度的曲面都很陡峭，可見光照度是影響力最大的因素。通過等高線圖及響應面圖可見瓊脂濃度與pH值的交互作用影響力最大，其次是光照度與pH值，影響力最小的是光照度與瓊脂濃度的交互作用。

2.2.3 模擬方程的驗證試驗 通過二次回歸方程的分析可得出紅顏草莓增殖的最優(yōu)條件如下：瓊脂濃度為7.08 g/L，pH值為5.37，光照度為2 176.99 lx，最佳增殖系數(shù)預測值為10.930 5。對該模型進行3次驗證試驗， 試驗條件如下：瓊脂濃度為7.1 g/L，pH值為5.37，光照度為2 177 lx。每次處理10個不定芽，得出的3次結果為10.7、11.2、10.3，平均值為10.73。與預測值十分接近，說明方程與真實試驗擬合度較好，該優(yōu)化方案有實際意義和可行度。

3 討論與結論

光照度是影響植物光合作用的主要因素，在一定范圍內，隨著光照度的增強， 植株長勢隨之變好。但光照度超過一定

范圍，則會對植物產生不利影響[9]。不同種類的組培苗所需光照差異性較大，如紅樹莓增殖階段的最適光照度為 1 500 lx[10]，紫花含笑在8 000 lx的強光下更適于芽的生長[11]，金葉復葉槭在4 200 lx的光照度下生長效果最佳[12]，香蕉組培苗增殖階段只需1 000 lx光照度[13]。在組培的不同階段，所需光照度不同，通常在生根階段組培苗所需的光照更多，隨著組培苗生長狀態(tài)的變化，要合理調控光因素，才可使植株更好生長，可見光照是影響組培苗生長的重要因素。不同植物所需的培養(yǎng)基酸堿環(huán)境不同，本試驗證明，紅顏草莓更適于酸性培養(yǎng)基。瓊脂有凝固培養(yǎng)基的作用，可影響培養(yǎng)基內的水分，其濃度對植物生長也存在一定影響。瓊脂濃度低，培養(yǎng)基內水分多，不利于植物生長分化，會有玻璃化現(xiàn)象產生;瓊脂濃度高，培養(yǎng)基偏硬，會使植物失水，造成植株萎蔫[14]。這與本試驗結果一致，在單因素試驗中，瓊脂濃度低于 7 g/L 時，有玻璃化現(xiàn)象，植株長勢不佳。

在試驗中發(fā)現(xiàn)，光照度過高、瓊脂濃度過低時會產生玻璃化苗。玻璃化是一種植物在離體快繁中發(fā)生的生理、形態(tài)異常的現(xiàn)象，可危害試管苗正常生長。玻璃化苗植株矮小，莖干透明狀，葉片透明狀，脆弱失綠，長勢不佳[15]。產生玻璃化的原因有很多，高溫密封的培養(yǎng)環(huán)境、高濃度的植物激素加速了植物生長，瓶內氣體濃度發(fā)生變化，供植物正常生長的氣體交換環(huán)節(jié)受到影響，易產生玻璃化[16]。溫度過高、濕度過大、生長調節(jié)劑濃度高、繼代次數(shù)太多，都易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，影響植株長勢[17]。對于輕度的玻璃化苗，增加蔗糖濃度，添加活性炭可使其緩解或恢復[18]。在組培試驗中，要嚴格控制通風、溫度、光照等培養(yǎng)環(huán)境，控制激素濃度，避免或減少玻璃化苗的產生。

在單因素試驗中，光照度、瓊脂濃度、pH值的最佳增殖系數(shù)分別為6.9、6.5、5.9。而優(yōu)化試驗中最佳增殖系數(shù)為 10.73，明顯高于單因素的試驗結果。響應面分析法是一種試驗次數(shù)少、回歸方程精度高、能研究多因子間交互作用的研究方法，其高效便捷，可節(jié)省人力、成本和時間[19-20]。優(yōu)化試驗的結果顯示，最適合紅顏草莓增殖的培養(yǎng)環(huán)境如下：瓊脂濃度 7.1 g/L，pH值為5.37，光照度為2 177 lx，增殖系數(shù)為 10.73。陳英等研究得到的最佳增殖系數(shù)為6.62[21]。翟婷婷研究得出的最佳增殖系數(shù)為5.0[22]，與現(xiàn)有研究相比本試驗的增殖系數(shù)高于已報道的部分研究結果，說明篩選增殖條件有實際意義。

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收稿日期：2018-09-05

基金項目：吉林省重點科技攻關項目（編號：20140204026NY）。

作者簡介：姚思揚（1994—），女，山東壽光人，碩士研究生，主要從事觀賞植物資源引種馴化及繁殖技術研究。E-mail：1575603119@qq.com。

通信作者：趙春莉，博士，副教授，主要從事觀賞植物資源引種馴化及繁殖技術研究。E-mail：zcl8368@163.com。