楊雪梅，范 雪，田可川，黃錫霞，朱 樺，阿布來提·蘇來曼，陳華峰，何軍敏，趙冰茹，徐新明，付雪峰，田月珍，吳偉偉，哈尼克孜·吐拉甫，杜建文

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】蘇博美利奴羊是通過系統(tǒng)選育而成的羊毛細(xì)度為17.0～19.0 μm精紡用超細(xì)毛羊新品種，該品種成年公羊和母羊肩胛部平均羊毛細(xì)度的最細(xì)記錄分別為16.42、17.85 μm[1]。羊毛的生長發(fā)育與毛囊的結(jié)構(gòu)和特性密切相關(guān)，中國超細(xì)毛羊(甘肅型)在胎齡138 d時，大部分初級毛囊與部分次級毛囊發(fā)育成熟[2]。而蘇博美利奴羊在胚胎期65 d，初級毛囊形成；在胚胎期85 d次級毛囊形成；在胚胎期105 d次級獲得性毛囊形成；在胚胎期135 d，毛囊基本成熟[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】羊毛的品質(zhì)及其商業(yè)價值是由毛囊的結(jié)構(gòu)和特性決定，若想要提高羊毛的品質(zhì)及產(chǎn)量，要研究其毛囊的發(fā)生發(fā)育，增加與毛囊發(fā)育有關(guān)基因的功能了解，才能更好的提高羊毛的質(zhì)量與產(chǎn)量。在毛囊發(fā)育過程中，幾種分泌的信號分子家族涉及表皮和真皮之間的通信[4-5]。其中，WNT家族似乎是表皮早期發(fā)育的最早和最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[6]。WNT2基因是WNT家族的成員之一，與腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移[7]。有研究表明，WNT2基因在細(xì)胞的生長、增殖過程中起重要作用[8]。此外，F(xiàn)u J等[6]不僅確定了產(chǎn)生WNT的細(xì)胞類型，還揭示了在毛囊形態(tài)形成的不同階段WNT信號的高度調(diào)節(jié)動態(tài)。推測WNT2基因可能是綿羊毛囊發(fā)育的潛在關(guān)鍵基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在過去的幾年里，已經(jīng)對該品種進(jìn)行了毛囊結(jié)構(gòu)[3]、表達(dá)分析[9-10]及產(chǎn)毛性狀[11]的研究，調(diào)節(jié)羊毛生長的分子機(jī)理尚未完全了解。毛囊發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)研究、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析及生物信息學(xué)分析可能是闡明羊毛生長分子調(diào)控機(jī)制的另一種策略。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用qRT-PCR法對蘇博美利奴羊毛囊成熟時期WNT2基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行研究，使用PROMO軟件預(yù)測WNT2基因啟動子區(qū)域序列的轉(zhuǎn)錄因子，并用Cytoscape_v3.5.1軟件可視化，使用MEGA 7.0軟件分析WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成成分及密碼子的偏好性，并且利用綿羊、山羊、牛、人等9個物種的WNT2基因的DNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。為了解蘇博美利奴羊WNT2基因的分子結(jié)構(gòu)和進(jìn)化特征奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步揭示W(wǎng)NT2基因在羊毛性狀調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物

從新疆科創(chuàng)繁育中心采集3只2周歲左右健康無病、體況均勻的經(jīng)產(chǎn)蘇博美利奴母羊(平均纖維直徑約17.73 μm)胚胎期135 d(毛囊成熟時期)左側(cè)肩胛部皮膚組織及心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織。將各組織樣本保存于液氮中，且均為3個生物信息學(xué)重復(fù)。

1.1.2 主要試劑

EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox購自ABM(加拿大)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購自TakaRa公司(日本)、DL 2000 DNA Marker與6×Loading Buffer購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

取組織樣品50～100 mg于液氮中研磨，使用Trizol法對蘇博美利奴羊的7個組織樣品進(jìn)行總RNA的提取。使用核酸檢測儀檢測其濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性；將檢測合格的總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成。

1.2.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI上公布的綿羊WNT2基因(GenBank NO. NM_001195319.1)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GenBank NO. NM_001190390.1)的序列，利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，最后由上海生工生物工程有限公司合成。表1

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測

以cDNA為模板，對目的基因WNT2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL， cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序為95℃ 3 min，94℃ 30 s，63℃ 45 s，35個循環(huán)，72℃ 5 min。隨機(jī)選擇4個PCR產(chǎn)物取2 μL與3 μL的6×Loading Buffer混勻，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠180 V電泳25min，以DL2000為Marker來標(biāo)記產(chǎn)物片段的大?。恢笫褂媚z成像儀進(jìn)行照膠，若獲得的產(chǎn)物片段與預(yù)期片段大小一致，可進(jìn)行下一步試驗。

實時熒光定量PCR以蘇博美利奴羊不同組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以GAPDH基因為內(nèi)參基因進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL：EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 5 s，共40個循環(huán)，65℃ 5 s，95℃ 5 s。每個樣品均為3個生物信息學(xué)重復(fù)。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測、核苷酸組成及密碼子偏好性

下載NCBI上公布的綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列，使用在線軟件PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi dirDB=TF_8.3)對該基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測，并用Cytoscape_v3.5.1軟件進(jìn)行可視化；使用MEGA 7.0軟件估計綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成及密碼子偏好性分析。

1.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

下載NCBI上公布的綿羊(Sheep)、山羊(Goat)、牛(Bos taurus)、人(Human)、馬(Horse)、豬(Pig)、恒河猴(Rhesus monkey)、北白頰長臂猿(Northern white-cheeked gibbon)、蘇門答臘猩猩(Sumatran orangutan)、兔(Rabbit)、家鼠(House Mouse)等11個物種的WNT2基因的DNA序列，使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

蘇博美利奴羊不同組織中目的基因WNT2基因與內(nèi)參基因GAPDH基因的相對表達(dá)量采用2-△△Ct方法進(jìn)行計算，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt目的組-ΔCt對照組，并用SPSS 19.0軟件單因素方差分析中的Duncan′s多重比較對表達(dá)量結(jié)果進(jìn)行差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測

研究表明，擴(kuò)增出來的片段是109 bp，與預(yù)期的大小相同，無非特異性擴(kuò)增的條帶，反應(yīng)體系合理，反轉(zhuǎn)錄的cDNA可以用于后續(xù)的試驗。圖1

注：M：DL2000 DNA Marker；1-4：WNT2基因

2.2 實時熒光定量PCR檢測

研究表明，WNT2基因與GAPDH基因有且只有一個峰，WNT2基因的熔解溫度為84℃，GAPDH基因的熔解溫度為84.5℃，引物特異性強(qiáng)。圖2，圖3

圖2 WNT2基因的擴(kuò)增曲線(A)、熔解曲線(B)及熔解峰(C)Fig.2 Amplification Curve(A), Melting Curve(B) and Melting Peak(C) of WNT2 Gene

圖3 GAPDH基因的擴(kuò)增曲線(D)、熔解曲線(E)及熔解(F)Fig.3 Amplification Curve(D), Melting Curve(E) and Melting Peak(F) of GAPDH Gene

2.3 WNT2基因在胚胎期135 d不同組織中的表達(dá)

研究表明，皮膚的ΔCt值最小，將皮膚作為對照組進(jìn)行表達(dá)量的計算。WNT2基因在各組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量各不相同。WNT2基因在皮膚組織中的表達(dá)量極顯著的高于其他6個組織(P<0.01)，且WNT2基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉6個組織之間表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。圖4

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.4 轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測

通過使用在線軟件PROMO對綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測分析，并用Cytoscape_v3.5.1軟件可視化，研究表明，共預(yù)測出101個與綿羊WNT2基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子與WNT2基因存在一定的調(diào)節(jié)關(guān)系，可能是正向調(diào)控，也可能是負(fù)向調(diào)控。圖5

圖5 WNT2基因啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子Fig.5 Transcription factors in the promoter region of WNT2 gene

圖6 核苷酸組成成分Fig.6 Nucleotide composition

2.5 綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列核苷酸組成成分

通過使用MEGA 7.0軟件分析了WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成成分，研究表明，WNT2基因啟動子區(qū)域序列的4種堿基的所占比例大致相同，T為25.90%，C為24.90%，A為25.80%，G為23.30%。圖6

2.6 綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列密碼子偏好性分析

研究表明，共有667個密碼子在綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域，而編碼氨基酸的密碼子有644個。其中，AAA的數(shù)量最多，共有26個，占總密碼子的3.9%；而CGU的數(shù)量最少，有2個，占總密碼子的0.3%。RSCU值說明了同義密碼子的相對使用度，AUG與UGG的RSCU值為1，這兩個密碼子的使用不存在偏好性；CAG與UCU的RSCU值相對其他密碼子較大，分別為1.42和1.40，說明這兩個密碼子是使用相對較多的密碼子；而CCG與CGU的RSCU值相對其他密碼子較小，分別為0.41和0.23，這兩個密碼子是使用相對較少的密碼子。通過對密碼子的數(shù)量及RSCU值的分析發(fā)現(xiàn)，密碼子數(shù)量與使用偏好性不存在直接的關(guān)系。表2

研究表明，667個密碼子決定了20種氨基酸，而每一種氨基酸的所占比例各不相同。絲氨酸的由73個密碼子決定，而甲硫氨酸僅由5個密碼子決定。圖7

圖7 密碼子決定氨基酸種類Fig.7 Types of amino acids determined by codons

2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建了綿羊、山羊、牛、人、馬、豬、恒河猴、北白頰長臂猿、蘇門答臘猩猩、家鼠與兔等11個物種的WNT2基因的DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，由研究表明，家鼠和兔與其他9個物種進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，而這9個物種聚為了2個大的分支，綿羊、山羊、牛、馬、豬聚在一個大的進(jìn)化分支，而人、恒河猴、北白頰長臂猿、蘇門答臘猩猩聚在另一個大的進(jìn)化分支。圖8

圖8 WNT2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic Tree of WNT2 Gene

表2 綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列密碼子偏好性Table 2 Codon preference in the promoter region of sheep WNT2 gene

3 討 論

WNT信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等過程，以及鄰近細(xì)胞間的相互作用[12-13]。一些研究表明，WNT信號通路廣泛參與毛囊形態(tài)發(fā)生的各個環(huán)節(jié)[14]，該通路對所有類型毛囊形態(tài)發(fā)生都是非常重要[15]，尤其在毛囊發(fā)生的起始階段起到至關(guān)重要的作用[16]。根據(jù)以往的研究，已知毛發(fā)的生長發(fā)育受毛囊周期變化的調(diào)節(jié)[17]。WNT信號通路中的WNT2在毛囊形態(tài)發(fā)生中起到重要作用，調(diào)節(jié)毛發(fā)長度[18]。

研究采用qRT-PCR法對蘇博美利奴羊毛囊成熟時期WNT2基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WNT2基因在7個組織中均有表達(dá)，而在皮膚組織中的表達(dá)量極顯著的高于其他6個組織(P<0.01)。已有報道證明WNT2基因在山羊各組織中均有表達(dá)，但在胚胎期90 d時，WNT2基因在肺臟中的表達(dá)量高于皮膚，而在心臟、肝臟及腎臟的表達(dá)量低于皮膚[19]，與研究結(jié)果部分一致?？赡苁荳NT2基因在不同品種羊皮膚組織中的表達(dá)量不同，也有可能是研究時期不同造成表達(dá)量不同。馮新宇[20]表明WNT2基因的表達(dá)下調(diào)會激活凋亡通路，造成細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步說明WNT2基因?qū)γ业纳L發(fā)育具有促進(jìn)作用。

轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動子上特定的DNA序列結(jié)合以激活或抑制特定基因的表達(dá)，研究通過對綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，共預(yù)測出101個相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，與WNT2基因存在或正或負(fù)的調(diào)節(jié)關(guān)系，但具體調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究。通過對綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成成分分析發(fā)現(xiàn)，4種堿基呈現(xiàn)均勻分布。對密碼子偏好性分布分析發(fā)現(xiàn)，CAG與UCU是使用相對較多的密碼子，而啟動子區(qū)域的絲氨酸，由73個密碼子決定。在不同物種之間構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以揭示綿羊WNT2基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)山羊和綿羊之間的進(jìn)化關(guān)系比與其他動物進(jìn)行比較時更為接近，這與薛麗娜等[21]的研究結(jié)果一致。

miRNA是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，也可能是表型調(diào)控的潛在位點(diǎn)[22]。一些miRNA在細(xì)胞分化和皮膚毛囊的增殖中起著關(guān)鍵作用，它們的靶基因在毛囊的周期性生長中起著重要作用。Chen Y等[23]表明miRNA對WNT2基因表達(dá)的調(diào)節(jié)可能依賴于轉(zhuǎn)錄降解，miR-125a通過影響WNT信號通路中基因的mRNA表達(dá)水平參與毛囊發(fā)育，如WNT2、β-連環(huán)蛋白1 (Catenin beta 1,CTNNB1)、淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子1 (Lymphoid Enhancer Binding Factor 1,LEF-1)及過氧化物酶體增殖物激活受體δ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Delta,PPARD)。WNT基因家族編碼大量分泌蛋白，作為信號蛋白在細(xì)胞間傳遞，使細(xì)胞分化。而研究結(jié)果表明WNT2基因在蘇博美利奴羊胚胎期135 d的表達(dá)量最高，說明WNT2基因編碼的WNT2蛋白可能在綿羊皮膚組織中大量存在。

4 結(jié) 論

WNT2基因在皮膚組織中的表達(dá)量極顯著高于心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及肌肉組織。在綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列共預(yù)測出101個相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，4種堿基呈現(xiàn)均勻分布，CAG與UCU的是使用相對較多的密碼子，對WNT2基因的DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)山羊和綿羊之間的進(jìn)化關(guān)系比與其他動物進(jìn)行比較時更為接近。