陳小敏，吳海冰 ，辜運富

(1.四川省綿陽市農(nóng)業(yè)科學研究院食用菌研究所，四川 綿陽 621000；2.四川農(nóng)業(yè)大學資源學院，成都 溫江 611130)

香菇作為世界第2大食用菌，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，被稱為“山珍”和“植物皇后”。我國擁有豐富的香菇菌種資源，人工種植地主要集中在河南、福建、四川等地[1-2]。香菇子實體的表型特征容易受環(huán)境因素的影響而出現(xiàn)不穩(wěn)定，生長環(huán)境不同導致同一菌種在形態(tài)特征上表現(xiàn)出明顯的差異，所以僅靠傳統(tǒng)形態(tài)學特征對香菇進行分類和鑒定存在一定的局限性。分子生物學的迅速發(fā)展，分子水平鑒定方法突破了傳統(tǒng)方法的局限，為學者們從分子水平上研究食用菌差異性和親緣關系提供了有力的手段。

DNA分子標記技術不受環(huán)境因子以及基因表達與否的限制，具有較高的多態(tài)性[3]。相較于形態(tài)學特征以及生理生化指標，分子標記技術因客觀性更強、操作簡便易行、特異性好、準確性高而越發(fā)受到關注?；贒NA片段的分子標記技術，能夠準確反映生物體由于遺傳變異所引發(fā)的核苷酸序列的差異性，在食用菌菌株遺傳多樣性研究、菌株鑒定、基因定位、種質(zhì)資源評價等領域發(fā)揮著不可或缺的作用[4]。目前研究食用菌遺傳多樣性，應用較廣泛的DNA分子標記技術主要包括：ITS、AFLP、SRAP、ISSR和RFLP等。

ISSR技術能較好地揭示和分析不同物種的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，廣泛應用于研究遺傳多樣性、基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建和種質(zhì)資源鑒定等領域[5]。同樣，ISSR技術也在廣泛用于研究大型真菌基因組，檢測基因組多個位點的差異性，例如研究香菇、黑木耳、金針菇、茯苓、蘑菇、羊肚菌等食用菌的遺傳多樣性、菌株鑒別[6]。利用ISSR技術研究不同遺傳背景的野生毛木耳菌株的遺傳差異性，有助于提升毛木耳育種水平，為培育優(yōu)質(zhì)的毛木耳新品種奠定理論依據(jù)[7]。利用ISSR技術研究中歐兩國蜜環(huán)菌菌株的遺傳多樣性，研究表明地理隔離導致蜜環(huán)菌菌株表現(xiàn)出遺傳差異，在系統(tǒng)發(fā)育樹上位于各自的進化分支[8]。采用ISSR技術分析不同來源的樺褐孔菌菌株，成功地將21個菌株劃分為6大類群[9]。以香菇為材料，采用ISSR技術確證了(TGTA)n微衛(wèi)星基序的存在，在后續(xù)研究中結(jié)合ITS序列分析，有效鑒定了香菇生產(chǎn)菌株[10-11]。Zhang等研究17個中國香菇菌株ISSR指紋圖譜，成功鑒定出全部供試菌株[12]。

目前香菇菌種混亂，品質(zhì)穩(wěn)定性較差且存在退化現(xiàn)象，嚴重阻礙了香菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此本研究廣泛收集香菇種質(zhì)資源和野生資源，通過ITS和ISSR分子手段評價種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為后續(xù)雜交育種、原生質(zhì)體融合育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試香菇菌株共計75株，引自全國各地，從上海食用菌研究所、華中農(nóng)大菌種實驗中心、福建三明真菌研究所等地引進香菇資源53份。野生資源22份，采自四川石棉、瀘定和冕寧等地，具體信息見表1所示。

表1 供試菌株

1.2 野生資源的分離及引進資源的活化

PDA固體培養(yǎng)基配制：土豆去皮切成小塊，稱取200g，加入適量的水，沸水煮20min，經(jīng)4層紗布過濾，取濾液[13]。往濾液中加無水葡萄糖20g、瓊脂20g煮沸，最后加水補足到1000mL，pH自然。

野生香菇菌株分離：清理子實體表面雜質(zhì)，用75%酒精對表面進行消毒。撕開子實體，用鑷子取黃豆大小菌肉置于PDA斜面培養(yǎng)基中，25℃恒溫避光培養(yǎng)。查看香菇菌絲的生長情況，選取未污染的菌絲進行純化。

1.3 香菇遺傳多樣性研究

1.3.1 香菇菌株DNA提取 利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工Sangon Biotech)提取供試香菇樣品的DNA。挑取培養(yǎng)基中表面的菌皮，用濾紙吸干菌絲表面水分，用液氮研磨，按照試劑盒給定的步驟依次進行操作。在含EB的1%瓊脂糖凝膠上水平電泳，120 V/cm電泳10min，以DNA MarkerDL 2000作為分子量標準，用凝膠成像儀檢驗DNA條帶，分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度。DNA純度高，無降解，RNA干擾小，可進行后續(xù)實驗，提取出的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ITS擴增 用通用引物ITS1(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對75株香菇菌株的ITS序列進行擴增[14]。反應體系為30μL：2×Taq PCR Master Mix 15μL(TIANGEN)、引物ITS1/ITS4各0.5μL(10μmol.L-1)、DNA模板1μL(10ng.μL-1)，加ddH2O補齊至30μL。擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，32個循環(huán)；72℃最終延伸1min；10℃終止反應[15]。取PCR產(chǎn)物3μL在含EB的1%瓊脂糖凝膠上水平電泳檢測，120V/cm電泳20min，以DNA MarkerDL2000作為分子量標準，自動凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。將其產(chǎn)物交由擎科生物技術有限公司(成都)完成測序，向NCBI提交供試香菇菌株的ITS序列，獲得基因登錄號。

1.3.3 ISSR擴增 在前期的試驗中，選用引物P1-P49進行ISSR擴增，結(jié)果表明引物P8(5’-GGAGGAGGAGGAGGA-3’)擴增效果最佳，譜帶穩(wěn)定、清晰、多態(tài)性豐富。反應體系為20μL：2×Taq PCR Master Mix 10μL(TIANGEN)、DNA模板1μL(10ng.μL-1)、引物P82μL(10μmol.L-1)，ddH2O補齊至20μL。擴增程序：94℃預變性2min；94℃變性1min，52℃復性1min，65℃延伸8min，30個循環(huán)；65℃最終延伸16min；4℃終止反應[15]。取PCR產(chǎn)物8μL在含EB的2%瓊脂糖凝膠上水平電泳檢測，80V/cm電泳1.5h，以DNA MarkerDL2000作為分子量標準，自動凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。根據(jù)ISSR擴增出的譜帶圖，將同一位置條帶出現(xiàn)與否記為1、0，構(gòu)建數(shù)字化矩陣，用軟件NTSYSpc2.1進行遺傳聚類分析[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用Excel進行平均值和標準值計算，SPSS進行方差、顯著性和相關性分析。利用NTSYSpc2.1構(gòu)建基于ISSR分析的聚類圖譜。用DNAMAN分析香菇供試菌株間的相似性，在Genbank中下載相似度較高的序列，利用MEGA5的Neighbor-Joining tree程序構(gòu)建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR聚類分析

對供試香菇菌株進行ISSR-PCR擴增，篩選得到引物P8，擴增出的條帶清晰，多態(tài)性及穩(wěn)定性較高，樣品間重復性較好。供試香菇ISSR-PCR擴增出的條帶大小在2000 bp-100 bp之間，供試菌株間擴增出的條帶表現(xiàn)出明顯的差異性，表明不同香菇菌株間存在明顯的遺傳差異性。根據(jù)ISSR擴增出的條帶進行聚類分析，得到香菇菌株間的聚類圖譜(圖1)。

圖1 供試菌株的ISSR聚類分析

從圖中可以看出，供試的75株香菇菌株總體相似性為62%，具有明顯的遺傳多樣性。遺傳相似系數(shù)小于0.62時，所有的供試菌株都聚為一類。在0.74的水平上，供試菌株大致分為6類，其中菌株11、63、73單獨聚為一類，菌株56、39、63、72和37聚為一類，菌株69、26、18、2、16、31、7和5聚為一類，其余的香菇菌株聚在一類。

2.2 供試菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

對供試75株菌株進行ITS-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后檢測得到單一條帶(圖2所示)，對PCR產(chǎn)物進行測序。供試菌株的ITS序列片段長度大約為750bp，將測序得到的75個香菇菌株的ITS序列進行Blast(NCBI數(shù)據(jù)庫)比對，比對結(jié)果顯示供試菌株均與香菇菌株的相識度較高，這表明供試菌株均為香菇菌株。

圖2 供試菌株ITS-PCR擴增條帶

選擇匹配度最高的香菇參比菌株，并提交至NCBI，并獲得了基因登錄號。以糙皮側(cè)耳平菇(Pleurotusostreatus)和金針菇(Flammulinavelutiper)為外類群，對75個供試香菇菌株和5個GenBank參比序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3所示)。如圖3所示，供試香菇菌株與4株香菇參比菌株聚在一起，而與外類群平菇明顯分開。供試菌株大致可以分為5大類群，其中57、60、68、67、69、72、66和63聚為一類，54聚為一類，55聚為一類，61、73、62、64、65、58、71和56聚為一類，其余菌株聚為一類。其中57和60相識度為99%，說明這兩個菌株的親緣關系較近。

圖3 供試菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

分子生物學的發(fā)展，推動了分子標記技術在食用菌遺傳多樣性上的研究，學者們采用DNA序列分析研究食用菌的系統(tǒng)發(fā)育學，自1994年ISSR分子標記技術提出以來，廣泛用于評價靈芝、香菇等食用菌遺傳多樣性[17-18]和菌株的鑒定鑒別[19]。不同的香菇菌株的DNA序列存在差異，在ISSR-PCR擴增時不同香菇菌株DNA序列與引物P8結(jié)合，擴增出獨特的ISSR條帶，因此ISSR分子標記技術能反應出供試香菇菌株間的遺傳多樣性。在本試驗中，供試香菇菌株的ISSR電泳圖譜具有明顯的差異性，聚類分析顯示出相似系數(shù)小于0.62時，供試75株香菇菌株聚為一類，在相似系數(shù)為0.74時，供試菌株聚類6大類群，說明供試75株香菇菌株間表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性。

基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹是目前研究靈芝、香菇等食用菌種間、種內(nèi)水平差異的主要分子手段。本研究中基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將供試75株香菇菌株分為5大類群，其中菌株57(LDT11-77)和60(LDT2011.2)相似度99%，且這兩個野生菌株均采集同一地區(qū)，則野生菌株LDT11-77和LDT2011.2疑是同種異名菌株。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，引進資源聚在一個類群，明顯的與野生資源分開，這可能是四川野生資源與引進資源存在地理隔離，從而引起遺傳差異。前人通過ITS測序研究中國香菇種質(zhì)資源的遺傳多樣性，結(jié)果表明西南地區(qū)野生香菇資源遺傳多樣性最為豐富。從本研究系統(tǒng)發(fā)育樹上看，采自于四川的野生野生資源分屬于不同的類群，說明四川野生香菇資源具有豐富的遺傳多樣性。