陳思仲 唐俊波 宣偉軍 韋瑀龍 宣毅

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 1第一臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣西 南寧 530023； 2瑞康醫(yī)學(xué)院制藥廠； 3 School of Engineering,Tufts University)

研究表明〔1～3〕，復(fù)方健耳劑具有明顯對(duì)抗小鼠耳蝸毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡,保護(hù)聽力的作用，其作用機(jī)制與其干預(yù)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)介導(dǎo)程序性聯(lián)級(jí)反應(yīng)細(xì)胞死亡途徑有關(guān)，然而，細(xì)胞凋亡徑路涉及因子眾多而且復(fù)雜，因此其藥理作用機(jī)制仍未明了，本文以C57BL/6J小鼠老年性聾為模型，觀察復(fù)方健耳劑干預(yù)Fas配體(L)、細(xì)胞色素(cyt)C基因、caspase-3因子表達(dá)影響，探討中藥防治老年性聾作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 動(dòng)物老年性聾模型建立〔1～6〕，選擇1月齡剛斷奶國產(chǎn)健康C57BL/6J小鼠15只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司提供〔批號(hào):SCXK(京)2012-0001〕，雌雄不拘，隨機(jī)分為2月齡對(duì)照組、7月齡對(duì)照組和7月齡中藥組各5只。對(duì)照組自斷奶后飲用自來水直至月齡，中藥組自斷奶后飲用中藥溶液以代替日常飲水直至7月齡。

mRNA合成單鏈擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)在NCBI數(shù)據(jù)庫查找相關(guān)序列，由北京六合華大基因科技股份有限公合成，GoldView Ⅰ型核酸染色劑購于上海索萊寶生物科技有限公司，總RNA抽提試劑盒由美國Axygen公司提供。采用美國Bio-Rad實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)系統(tǒng)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及用量 復(fù)方健耳劑主要由葛根、丹參、黃芪、骨碎補(bǔ)等組成。經(jīng)過水煮、濃縮、烘干、反復(fù)粉碎和過篩等流程，制成每克藥粉相當(dāng)于6.63 g生藥材。小鼠與成人用量換算法計(jì)算出該藥的小鼠用量3.65 g/(kg·d)〔7〕。1～3月齡，中藥粉加適量比例水配兌(一般為0.05 g藥粉加5 ml水)，盛于動(dòng)物自吸喂養(yǎng)瓶?jī)?nèi)供小鼠飲用,在無其他水源供應(yīng)的條件下，動(dòng)物每日飲下規(guī)定的內(nèi)服中藥劑量，待成長(zhǎng)至4月齡后，改用人工灌喂法以進(jìn)一步確保每日飲下足量中藥。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR 對(duì)耳蝸cytC、FasL、caspase-3 mRNA檢測(cè) 選擇PCR參考引物序列ACTB(5'-3'):上游AGTGTGACGTTGACATCCGT,下游AGTAACAGTCCGCCTAGAAGC。PCR目標(biāo)引物序列FasL(5'-3'):上游GAGGTCTGTGACTGAGGGAC,下游AAACGGCCTCTGTGAGGTAG;cytC上游AATCTCCACGGTCTGTTCGG,下游GGTCTGCCCTTTCTCCCTTC;caspase-3 上游CCACGTGGGAAAGTGAACCA，下游CAGGGCTATTGCTGGATGCT。將各組斷頭取耳蝸，置液氮中冰凍備用。按照總RNA小量制備試劑盒步驟提取總RNA，即將樣品剪成小塊，緩沖液R-Ⅰ溶液震蕩洗脫下軟組織，緩沖液R-Ⅱ振蕩混勻，離心取上清，分別加入異丙醇、緩沖液W1A、 緩沖液W2振蕩均勻并離心，棄濾液，最后加無水RNase離心洗脫得RNA?？俁NA瓊脂糖凝膠中電泳，判斷總RNA完整性。微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，樣本濃度均在100～300 ng/μl的范圍。按照反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明，取等量總RNA加入DNA Eraser緩沖液，無水RNase補(bǔ)充總體積，依次加入PrimeScript緩沖液、無水RNase、RT Primer混合物、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)合成cDNA。加入引物，在實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)系統(tǒng)中，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min,然后95℃15 s,60℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)，60℃延伸1 min,測(cè)出內(nèi)參基因ACTB和目的基因FasL、cytC在不同樣本中擴(kuò)增的Ct值，2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)量差異倍數(shù)值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

7月齡對(duì)照組較2月齡對(duì)照組FasL、cytC、caspase-3表達(dá)均明顯增高(P<0.05)。7月齡中藥組cytC、FasL、caspase-3表達(dá)量均值則顯著低于7月齡對(duì)照組(P<0.05)，與2月齡對(duì)照組比較則僅caspase-3水平差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1 3組耳蝸組織cytC、FasL、caspase-3 mRNA表達(dá)比較值，n=5)

與2月齡對(duì)照組比較:1)P<0.05；與7月齡對(duì)照組比較:2)P<0.05

3 討 論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化和病理狀態(tài)中細(xì)胞自主性死亡過程，是細(xì)胞內(nèi)由基因編碼調(diào)控的、按嚴(yán)格程序執(zhí)行的細(xì)胞自殺過程，又稱程序性死亡(PCD)，它廣泛存在于各種細(xì)胞中，與許多人類疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),其中神經(jīng)元死亡過程更多的是以凋亡形式表現(xiàn)，而凋亡的主要效應(yīng)蛋白包括caspase家族的蛋白酶，caspase級(jí)聯(lián)激活介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是目前公認(rèn)的經(jīng)典途徑〔8,9〕，它是一組具有相似的氨基酸順序、二級(jí)結(jié)構(gòu)的半胱氨酸蛋白酶家族，它的活化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，它的激活主要通過線粒體途徑和細(xì)胞膜途徑〔10，11〕。線粒體途徑主要由cytC激發(fā)誘導(dǎo)。cytC是一種眾所周知的線粒體蛋白，通過向呼吸鏈傳遞電子來維持ATP產(chǎn)生，從而完成維持生命的功能，然而，在凋亡機(jī)制的激活過程中，一旦線粒體受到某種有害因素影響后，不但導(dǎo)致能量代謝障礙，產(chǎn)生大量超氧陰離子，并通過鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成活性氧，使線粒體膜通透化，引起跨膜電位崩潰的同時(shí)，引起cytC從線粒體中外漏，在胞質(zhì)內(nèi)觸發(fā)內(nèi)源性凋亡通路中caspase級(jí)聯(lián)激活，即與細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1結(jié)合，在dATP/ATP存在條件下活化caspase-9，caspase-9再激活下游效應(yīng)caspase-3等，最終導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)凝聚和DNA裂解為碎片等細(xì)胞死亡特征，即誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔12～15〕。通過不同齡小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)〔16〕，感光能量伴隨著年齡老化而明顯下降與反映線粒體代謝有關(guān)的蛋白如線粒體分裂和融合蛋白——線性體內(nèi)源發(fā)動(dòng)蛋白(OP)1A蛋白、cytC氧化酶等伴隨著年齡下降有關(guān)，因此認(rèn)為與年齡相關(guān)的疾病和細(xì)胞死亡與線粒體功能隨年齡增長(zhǎng)而下降密切相關(guān)。而Fas是一種319氨基酸1型跨膜糖蛋白,有3個(gè)外半胱氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域和內(nèi)80個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域，稱為位于C-末端的死亡域(DD)。FasL是Fas的配體，為Ⅱ型跨膜糖蛋白，其N端150個(gè)氨基酸為腫瘤壞死因子(TNF)超家族同源區(qū)，F(xiàn)asL也是CD8+T細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞的主要效應(yīng)因子之一，它可與膜上3個(gè)Fas分子結(jié)合，并通過其胞內(nèi)DD與胞質(zhì)中Fas相關(guān)DD(FADD)結(jié)合，繼而通過 FADD末端死亡作用區(qū)域(DED)與鄰近的caspase-8中的DED結(jié)合，使caspase-8寡聚化，自身裂解而活化caspase-8，然后激活下游的caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中上游的啟動(dòng)子caspase-8激活后，還可以通過酶解Bcl-2家族中的Bid，變成tBid，使線粒體膜通透性改變，引起cytC釋放，導(dǎo)致caspase聯(lián)級(jí)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡。而Bcl-2與Bid相反，可阻止線粒體膜通透化，從而阻止cytC釋放，抑制細(xì)胞凋亡，因此，該途徑又稱死亡受體途徑。Fas-FasL與TNF一樣，是活化caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞膜途徑的關(guān)鍵啟起因子〔17～19〕。文獻(xiàn)報(bào)道〔11〕，F(xiàn)as和FasL在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有表達(dá)，但在炎癥和退化的大腦中表達(dá)增加，并被認(rèn)為參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫抑制狀態(tài)。Fas和FasL的表達(dá)在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中顯著升高，提示這種系統(tǒng)可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性和炎癥反應(yīng)中起重要作用。因此，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)asL系統(tǒng)應(yīng)被視為一把雙刃劍:維持正常腦內(nèi)免疫抑制狀態(tài)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)，F(xiàn)as-FasL被稱為一個(gè)典型的負(fù)責(zé)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)外源性細(xì)胞死亡系統(tǒng)。通過對(duì)青年小鼠和老年小鼠研究發(fā)現(xiàn)〔20〕，伴隨著年齡增長(zhǎng)，眼組織和血液中FasL表達(dá)增加，由此誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)增多，脈絡(luò)膜新生血管減少，以至老年性視功能下降，眼部激光治療能夠降低FasL表達(dá)，抑制MMP，從而促進(jìn)脈絡(luò)膜新生血管增多；通過對(duì)老年、中年、青年人血細(xì)胞Fas/FasL比較顯示〔21〕，老年人Fas/FasL明顯增加，同時(shí)分析認(rèn)為，老年人Fas/FasL高表達(dá)，與T淋巴細(xì)胞亞群比例失調(diào)導(dǎo)致免疫功能下降，由此介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。本次研究中cytC基因代表了cytC水平，由此提示，老年性耳蝸感音神經(jīng)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)可能是同時(shí)通過線粒體和細(xì)胞膜兩種途徑介導(dǎo)caspase級(jí)聯(lián)激活引發(fā)細(xì)胞PCD，這與前述文獻(xiàn)報(bào)道老年性相關(guān)疾病可通過細(xì)胞膜Fas-FasL激活和(或)線粒體功能障礙引起cytC異常增加并外泄引起細(xì)胞凋亡相符〔19～21〕,同時(shí)還提示復(fù)方健耳劑具有保護(hù)線粒體，防止cytC外泄或穩(wěn)定細(xì)胞膜，抑制FasL,以阻止其觸發(fā)caspase引起細(xì)胞PCD的藥理作用。

研究表明〔1～6〕，在C57BL/6J小鼠老年性聾模型中，2月齡聽力學(xué)和耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)保持正常狀態(tài)，7月齡則出現(xiàn)以高頻聽力損害為主，耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡以耳蝸基底部為重的病理變化，由此證實(shí)耳蝸感音神經(jīng)細(xì)胞凋亡伴隨著年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)從耳蝸底回向頂回不斷發(fā)展趨勢(shì)，聽功能損害也相應(yīng)出現(xiàn)從高頻向低頻不斷發(fā)展的規(guī)律，中藥制劑防治顯示其具有顯著對(duì)抗老年性耳蝸感音神經(jīng)細(xì)胞凋亡和保護(hù)聽力的作用，中藥防治具有顯著降低caspase-3表達(dá)的藥效作用〔2〕，與本次研究一致，由此提示，caspase是引起耳蝸感音神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要系統(tǒng)，是中藥藥理作用機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。之前研究還表明，復(fù)方健耳劑可以提高小鼠耳蝸組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)〔22〕，由此認(rèn)為其保護(hù)耳蝸感音神經(jīng)細(xì)胞作用可能機(jī)制除了可通過膜結(jié)合型GTP/GDP結(jié)合蛋白(Ras)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生系列生物學(xué)作用,即酪氨酸蛋白激酶(Trk)B是BDNF的功能型受體，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需，BDNF與TrkB結(jié)合，通過 Ras-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用，或通過激活神經(jīng)元特定的信號(hào)傳遞途徑或影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA活性，來保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激損傷等作用外〔23，24〕，近年研究證實(shí)〔25〕，BDNF可降低β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導(dǎo)caspase-3和鈣蛋白酶激活，通過全長(zhǎng)型酪氨酸蛋白激酶B受體(TrkB-FL)激活促進(jìn)神經(jīng)元存活，并且通過BDNF介導(dǎo)的腺苷A2A受體激活，保護(hù)突觸可塑性、傳輸和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放功能，因此，BDNF還能降低caspase-3活性，從而阻止細(xì)胞PCD〔25，26〕。但是，理論上影響caspase通路的因素錯(cuò)綜復(fù)雜，中藥還通過其他何種徑路啟動(dòng)，最終阻止caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有待研究。