熊力力，吳文旋，王 羽中，熊江林*，吳靈英*

（1.武漢輕工大學(xué)農(nóng)副產(chǎn)品蛋白質(zhì)飼料資源教育部工程研究中心，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，新農(nóng)村發(fā)展研究院，貴州貴陽(yáng) 550025；4.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，浙江杭州 311300）

黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)相似于霉菌毒素，由黃曲霉、寄生曲霉和少量特異曲霉產(chǎn)生。其中，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性最強(qiáng)，在不當(dāng)?shù)氖崭詈蛢?chǔ)存條件下產(chǎn)生進(jìn)而污染奶牛飼料。奶牛攝入AFB1污染的飼料后會(huì)在奶中分泌AFB1的羥基化代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）。據(jù)報(bào)道，日糧中AFB1轉(zhuǎn)化為乳中AFM1的比率為0.56%～0.59%和1%～3%，轉(zhuǎn)化率的差異受泌乳階段影響[1]。鑒于AFB1和AFM1的肝臟毒性和致癌性，它們被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為I類致癌物質(zhì)[2-3]。中國(guó)最新的飼料標(biāo)準(zhǔn)將奶牛精料補(bǔ)充料和植物性飼料原料中AFB1限值分別設(shè)定為10、30 μg/kg[4]。歐盟將奶牛飼料和飼料原料中AFB1限值分別設(shè)為5、20 μg/kg[5]，美國(guó)將奶牛飼料中黃曲霉毒素總量的法定限值設(shè)為20 μg/kg[6]。中國(guó)和美國(guó)將牛奶中AFM1的限值設(shè)定為500 ng/kg[7-8]，而歐盟的限值為50 ng/kg[9]。

盡管各國(guó)制定了飼料AFB1和牛奶AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)，但黃曲霉毒素的致癌、致畸和致突變性使得人們一直高度關(guān)注該毒素在牛奶和飼料中的污染情況。加強(qiáng)奶牛精料原料AFB1和牛奶產(chǎn)品AFM1的監(jiān)測(cè)，有利于生產(chǎn)安全牛奶。湖北省處于亞熱帶地區(qū)，氣候條件適合奶牛飼料原料的AFB1生成，引起牛奶AFM1污染。因此，本研究分別檢測(cè)湖北省飼料廠和奶牛場(chǎng)精料原料以及市售的巴氏滅菌奶和超高溫滅菌（Ultra High Temperature Treated，UHT）奶中AFB1和AFM1含量并分析其污染原因，為奶牛養(yǎng)殖和牛奶市場(chǎng)提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn) 本研究于2016年10月—2017年3月在湖北省武漢市、黃岡市、襄陽(yáng)市和十堰市進(jìn)行樣品采集，在武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 牛奶樣品 在12家商超采集某乳企2個(gè)主要品牌的UHT奶120份，另采集2家乳企生產(chǎn)的巴氏滅菌牛奶122份。2家乳企均為黃岡市和襄陽(yáng)市企業(yè)，采用黃岡市和襄陽(yáng)市奶牛場(chǎng)的奶源生產(chǎn)。樣品為調(diào)研期間生產(chǎn)的不同批次奶樣，處于保質(zhì)期內(nèi)。UHT奶儲(chǔ)存在4℃條件下，巴氏滅菌奶保存在-20℃條件下，在樣品保質(zhì)期內(nèi)進(jìn)行AFM1分析。

1.2.2 精料原料 從10家奶牛場(chǎng)和奶牛飼料生產(chǎn)廠采集162份飼料原料樣品。其中，玉米40份（奶牛場(chǎng):奶牛飼料生產(chǎn)廠為25:15）、麥麩21份（奶牛場(chǎng):奶牛飼料生產(chǎn)廠為13:8）、花生餅36份（奶牛場(chǎng):奶牛飼料生產(chǎn)廠為24:12）、大豆粕34份（奶牛場(chǎng):奶牛飼料生產(chǎn)廠為20:14）、芝麻餅31份（奶牛場(chǎng):奶牛飼料生產(chǎn)廠為24:7）。樣本來自不同批次，每一批次隨機(jī)采集5袋飼料，每袋取樣1.2 kg，即原料包裝上、中、下部位各取400 g，將6 kg樣品混勻后通過四分法取樣，最終獲得有代表性的次級(jí)樣品370 g。本采樣方法符合《飼料采樣方法》（GB/T 14699.1-2005）要求。飼料樣品在65℃下風(fēng)干，儲(chǔ)存在室溫條件下，1個(gè)月內(nèi)完成樣品AFB1檢測(cè)。

1.3 主要儀器與試劑 美國(guó)伯樂酶標(biāo)儀（型號(hào)BIORAD680）；德國(guó) eppendorf八通道移液槍（30～300 μL）；生化培養(yǎng)箱（型號(hào)BSP-250），上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。飼料AFB1檢測(cè)ELISA試劑盒（產(chǎn)品貨號(hào)R1211）和牛奶AFM1檢測(cè)ELISA試劑盒（產(chǎn)品貨號(hào)R1121），來自德國(guó)拜發(fā)（R-Biopharm AG，Darmstadt，Germany）。

1.4 檢測(cè)方法 參照AFB1和AFM1檢測(cè)試劑盒的使用說明書進(jìn)行檢測(cè)，包括樣品前處理、加樣加酶反應(yīng)、競(jìng)爭(zhēng)性酶結(jié)合反應(yīng)、顯色反應(yīng)、終止反應(yīng)5個(gè)步驟，并用設(shè)定好波長(zhǎng)為450 nm酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度（OD450）。試劑盒中的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品用于建立濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度推算樣品中黃曲霉毒素濃度。AFB1檢出限為1 μg/kg，回收率80%～100%，變異系數(shù)8%。AFM1檢出限為5 ng/kg，回收率約95%，變異系數(shù)14%。

本試驗(yàn)中，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行檢測(cè)，每20個(gè)樣品安排1個(gè)加標(biāo)樣品（檢測(cè)AFM1時(shí)，加標(biāo)濃度為0.010 μg/kg；檢測(cè) AFB1時(shí)，加標(biāo)濃度為 1 μg/kg），用以評(píng)定方法的可靠性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用非參數(shù)性檢驗(yàn)方法分析樣本中黃曲霉毒素濃度差異，即借助SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件中Mann-Whitney法進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)，顯著性檢驗(yàn)水平設(shè)定為P＜0.05。使用SPSS 11.5對(duì)陽(yáng)性樣本黃曲霉毒素濃度的中位數(shù)進(jìn)行描述性分析。AFB1、AFM1的平均濃度表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼料原料中AFB1污染情況 由表1可見，在檢測(cè)的162份樣品中有28.4%被AFB1污染，陽(yáng)性樣本平均濃度為28.5 μg/kg。AFB1污染濃度最高的樣本是玉米（368.0 μg/kg），其次是花生餅（315.3 μg/kg），分別有1個(gè)（2.5%）和3個(gè)（8.3%）樣本超過國(guó)家限值（30 μg/kg）。芝麻餅AFB1陽(yáng)性率最高（41.9%），小麥麩陽(yáng)性率最低 （4.8%），2類樣本AFB1均未高于國(guó)家限值，平均濃度分別為8.7 μg/kg和3.1 μg/kg。陽(yáng)性樣本AFB1濃度最低的是大豆粕，平均濃度為2.1 μg/kg，最高濃度5.9 μg/kg?；ㄉ炛蠥FB1平均濃度顯著高于玉米（P＜0.05）?；ㄉ灪陀衩椎腁FB1污染濃度顯著高于小麥麩、豆粕和芝麻餅（P＜0.05）。

表1 奶牛精料中主要飼料原料AFB1污染情況

2.2 牛奶中AFM1的污染情況 由表2可知，本次調(diào)研的242份牛奶中，72.7%檢測(cè)出AFM1，平均濃度98.1 ng/kg，最高濃度為346.2 ng/kg，且有32.2%超過歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)，但無樣本超過我國(guó)的限量標(biāo)準(zhǔn)。

受檢的122份巴氏滅菌奶中，有115份奶含AFM1（94.3%），陽(yáng)性樣本平均濃度為138.9 ng/kg，且有76份奶AFM1濃度超過歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)。受檢120份UHT奶中，有61份奶檢測(cè)到AFM1，陽(yáng)性奶樣平均濃度為21.2 ng/kg，并有2份奶AFM1濃度超過歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)。巴氏滅菌奶AFM1濃度顯著高于UHT奶（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 奶牛飼料原料中AFB1污染情況及控制 日糧AFB1污染可引起牛奶AFM1污染，因此需要加強(qiáng)對(duì)泌乳期奶牛日糧AFB1的監(jiān)控。為了維持奶牛泌乳性能，精料在泌乳奶牛的日糧中占比大，高產(chǎn)奶牛日糧中精料比例高達(dá)50%～60%。本調(diào)研發(fā)現(xiàn)，奶牛精料的主要組成原料是玉米、豆粕、麩皮，部分使用了花生餅和芝麻餅。因此，對(duì)這些原料進(jìn)行AFB1監(jiān)測(cè)可為奶牛日糧中AFB1的控制提供重要參考。Lutfullah等[10]對(duì)谷物AFB1調(diào)查發(fā)現(xiàn)，玉米最易遭受AFB1污染，陽(yáng)性率達(dá)40%。范或等[11]發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)玉米AFB1陽(yáng)性率為50.0%，4.5%樣本超過國(guó)家限值。這些研究結(jié)果與本研究相似。高秀芬等[12]和杜妮[13]報(bào)道，玉米污染比率分別為74.6%和77.0%，高于本研究的污染比率（25%）。本研究中AFB1平均濃度、最高濃度和污染區(qū)間與其他文獻(xiàn)存在較大差異，這些差異可能與田間管理（如及時(shí)灌溉）、收獲管理（如及時(shí)收獲、減少破損率）和儲(chǔ)存條件（如料倉(cāng)的衛(wèi)生和濕度情況）有關(guān)[14]。綜上，玉米易受AFB1污染，污染后濃度較高，不同時(shí)間和地區(qū)AFB1污染程度存在差異，其作為奶牛飼料原料需要嚴(yán)格監(jiān)控AFB1。

表2 巴氏滅菌牛奶和UHT牛奶AFM1污染情況

表3 國(guó)內(nèi)谷物及蛋白質(zhì)飼料中AFB1污染綜述

表4 巴氏滅菌奶和UHT奶AFM1污染情況

Li等[15]報(bào)道，長(zhǎng)三角地區(qū)花生樣本80%被AFB1污染，最高濃度達(dá)32.3 μg/kg。Ding 等[16]監(jiān)測(cè)了華東12省花生AFB1含量，25%樣本含有AFB1，1.0%樣本超過國(guó)家限量，平均濃度為2.13 μg/kg，最高達(dá)720 μg/kg。本研究中AFB1陽(yáng)性率和最高濃度介于上述報(bào)道相關(guān)值之間。上述研究結(jié)果顯示，花生及其產(chǎn)品易受AFB1污染，污染后AFB1濃度較高，奶牛飼料生產(chǎn)中要加強(qiáng)花生餅的AFB1監(jiān)測(cè)。

植物性飼料原料黃曲霉毒素含量受多種因素影響，包括種植活動(dòng)、氣候、谷物類型和儲(chǔ)存條件。因此，為了降低飼料中AFB1含量，必須有良好的生產(chǎn)管理規(guī)范，如適當(dāng)?shù)墓喔取⒄莆蘸檬斋@時(shí)間、保持谷物的完整性、水份控制在12%以下、保持谷倉(cāng)的衛(wèi)生并控制好儲(chǔ)存溫度[14]。

3.2 牛奶中AFM1污染情況及控制 本次調(diào)研的242份牛奶AFM1含量均低于國(guó)家限量，這與我國(guó)消費(fèi)者近年來對(duì)牛奶AFM1污染的關(guān)注、奶牛場(chǎng)監(jiān)測(cè)和各級(jí)政府加強(qiáng)監(jiān)管密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，巴氏滅菌奶和UHT奶的AFM1陽(yáng)性率較高，一些牛奶AFM1含量高于歐洲限量，因此，牛奶AFM1污染仍應(yīng)引起重視。日糧AFB1可以在奶牛體內(nèi)轉(zhuǎn)化為AFM1，分泌到奶中[1]，牛奶AFM1陽(yáng)性率高則反映了奶牛飼料AFB1污染比例高，故而要加強(qiáng)奶牛飼料AFB1的監(jiān)測(cè)。研究人員相繼報(bào)道了我國(guó)飼料AFB1污染情況：28.4%的精料原料（本研究）、74.6%玉米[12]、25%花生[16]、100%青貯料和100%粗料[18]被AFB1污染。因此，在飼料和牛奶生產(chǎn)過程中實(shí)施公共衛(wèi)生操作程序、HACCP規(guī)范和ISO標(biāo)準(zhǔn)等規(guī)范流程可降低牛奶AFM1的污染，奶牛飼料生產(chǎn)過程使用霉菌毒素吸附劑、分解酶和分解菌來降低AFB1吸收。

本研究顯示，UHT奶AFM1污染程度低于巴氏滅菌奶，這與Zheng 等[19]的研究結(jié)果一致。UHT奶占有我國(guó)40%液態(tài)奶市場(chǎng)，是最受我國(guó)消費(fèi)者歡迎的奶產(chǎn)品，其質(zhì)量和安全控制比巴氏滅菌奶嚴(yán)格。關(guān)于牛奶AFM1污染的報(bào)道見表4。本研究顯示，1.7%的UHT牛奶中AFM1含量超過歐盟限量，這一比率低于2010年中國(guó)（20.3%）[19]、伊朗（17.4%）[20]、印度（64.4%）[21]、2014—2015年中國(guó)（11.9%）[22]的數(shù)據(jù)。另外，本研究顯示63.6%的巴氏滅菌奶AFM1含量超過歐洲限量，這一比例高于伊朗（26.7%）[20]、印度（42.9%）[21]、2014—2015年中國(guó)（0）[22]的數(shù)據(jù)，但低于2010年中國(guó)（20.3%）[19]的數(shù)據(jù)。在本研究的文獻(xiàn)綜述中，卡塔爾牛奶AFM1污染程度最小，所有的UHT奶和巴氏滅菌奶AFM1均未超過歐盟限量[23]。本次調(diào)研的牛奶AFM1均未超過國(guó)家限量（500 ng/kg），而印度的巴氏滅菌奶和UHT奶高于該限值的比率分別為42.9%和22.2%[21]。不同國(guó)家牛奶AFM1含量的差異可能與氣候、地理?xiàng)l件以及奶牛飼料和乳品加工過程中黃曲霉毒素的監(jiān)控策略有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究中，28.4%奶牛精料原料含有AFB1，其中2.5%樣本超過我國(guó)限量（30 μg/kg），玉米和花生最易遭受AFB1污染，需要加強(qiáng)對(duì)易受AFB1污染的飼料原料的監(jiān)測(cè)，并積極探索有效的AFB1脫毒方法。另外，所有牛奶AFM1含量低于我國(guó)限量標(biāo)準(zhǔn)（500 ng/kg），但牛奶AFM1陽(yáng)性率高達(dá)72.7%，仍需加強(qiáng)原料奶和奶產(chǎn)品的AFM1控制和監(jiān)測(cè)。