許 霞,劉 菲,薛銀剛,①,屠博文,周璐璐,江曉棟,施昕瀾,薛 柯

(1.常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院,江蘇 常州 213164;2.江蘇省環(huán)境保護(hù)水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 常州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,江蘇 常州 213001;3.常州市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 常州 213022)

地下水是水資源的主要組成部分之一,占全球灌溉水量的40%[1]。近年來(lái),隨著人口的不斷增加和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,人類活動(dòng)對(duì)環(huán)境造成的污染不斷加重,地下水環(huán)境面臨不同程度的破壞[2]。目前關(guān)于地下水的研究集中于水污染修復(fù)、水污染物鑒定以及地表水和地下水的相互作用等方面[3-6],而我國(guó)關(guān)于地下水細(xì)菌群落的研究還較少。細(xì)菌群落特性與水生生態(tài)環(huán)境具有高度相關(guān)性,群落變化比水文地球化學(xué)指標(biāo)的變化更為敏感,其結(jié)構(gòu)特征和功能狀態(tài)可以反映水體生態(tài)系統(tǒng)對(duì)污染輸入脅迫的恢復(fù)力[7],群落多樣性被認(rèn)為是反應(yīng)環(huán)境敏感性的生物指標(biāo)之一[8],直接參與碳、氮、硫、磷和一些重金屬的生物地球化學(xué)循環(huán)[9]。

近年來(lái),分子生物學(xué)技術(shù)得到快速發(fā)展,研究細(xì)菌群落多樣性的方法逐步更新,16S rDNA克隆文庫(kù)[10]、PCR-DGGE[11]和宏基因組學(xué)[12]等技術(shù)被用于研究地下水細(xì)菌群落特征。工業(yè)產(chǎn)業(yè)向園區(qū)集中已經(jīng)成為我國(guó)工業(yè)企業(yè)發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì),工業(yè)園區(qū)地下水污染日趨嚴(yán)重,對(duì)區(qū)域生態(tài)和人居環(huán)境健康構(gòu)成不利影響[13],而目前關(guān)于利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)工業(yè)園區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。高通量測(cè)序技術(shù)是識(shí)別細(xì)菌群落整體概況的高效工具,已被廣泛應(yīng)用于多種復(fù)雜環(huán)境細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究,成為分析群落多樣性的一種有效手段[14-16]。該研究基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái),以工業(yè)園區(qū)地下水為研究對(duì)象,采用高通量測(cè)序方法,研究其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性,以期為地下水細(xì)菌群落研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為工業(yè)園區(qū)地下水生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)提供方法支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況和樣品采集

采樣區(qū)位于常州市某工業(yè)園區(qū),園區(qū)內(nèi)污染源主要集中在北部的鹽化工區(qū),周邊建有化工、化肥和制藥等環(huán)境敏感源。園區(qū)內(nèi)有保存完好的地下水監(jiān)測(cè)井,減少了鉆探工作量。與該研究有關(guān)的含水層主要為松散巖類孔隙微承壓水層,含水層巖性為粉土、粉砂和粉質(zhì)黏土。采樣時(shí)間為2016年12月,共選取5口淺層地下水監(jiān)測(cè)井(G1～G5),監(jiān)測(cè)井水深為9.94～11.99 m,水位為1.56～3.20 m。工業(yè)園區(qū)主要地下水污染源、鹽化工區(qū)、企業(yè)用地和5口地下水監(jiān)測(cè)井的相對(duì)位置見(jiàn)圖1。

地下水采樣前需進(jìn)行洗井工作,待抽出井管中的滯水后,讓含水層中的新鮮水充入井管,具體的抽水時(shí)間根據(jù)每口井的水深度和地下水的回水速度而定。完成洗井后,待地下水水位達(dá)到平衡,使用貝勒管(Safelab-123,北京賽福萊博科技有限公司)采集地面下2～4 m處的水樣。樣品采集后,置于聚乙烯瓶中冷藏保存并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用于水體理化指標(biāo)測(cè)定的水樣使用0.45 μm孔徑的混合纖維素濾膜過(guò)濾;用于高通量測(cè)序的水樣先經(jīng)5 μm孔徑濾膜過(guò)濾除去顆粒雜質(zhì),再通過(guò)0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾,將其保存于-20 ℃條件下,用于后續(xù)DNA提取。

圖1 工業(yè)園區(qū)采樣點(diǎn)位置示意

1.2 理化指標(biāo)測(cè)定

理化指標(biāo)的選取和分類參照GB/T 14848—2017《地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[17],檢測(cè)方法參照GB 5750—85《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[18]。所測(cè)定指標(biāo)包括14項(xiàng)一般化學(xué)指標(biāo)(pH值、總硬度、硫酸鹽、氯化物、鐵、錳、銅、鋅、揮發(fā)酚、陰離子表面活性劑、高錳酸鹽指數(shù)、氨氮、電導(dǎo)率和溶解氧),5項(xiàng)天然背景離子(鈉、鈣、鎂、鉀和碳酸氫根),14項(xiàng)毒理學(xué)指標(biāo)(亞硝酸鹽、硝酸鹽、氰化物、氟化物、汞、砷、硒、鎘、六價(jià)鉻、鉛、三氯甲烷、四氯化碳、苯和甲苯),37項(xiàng)非常規(guī)毒理學(xué)指標(biāo)〔二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、1,2-二氯丙烷、三溴甲烷、氯乙烯、1,1-二氯乙烯、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、氯苯、鄰二氯苯、對(duì)二氯苯、三氯苯(總量)、乙苯、二甲苯(總量)、苯乙烯、2,4-二硝基甲苯、2,6-二硝基甲苯、萘、蒽、熒蒽、苯并(b)熒蒽、苯并(a)芘、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、2,4,6-三氯酚、五氯酚、六六六、2,4′-滴滴涕、六氯苯、七氯、敵敵畏、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷、樂(lè)果和毒死蜱〕。

1.3 DNA提取

按照試劑盒說(shuō)明書步驟,使用Omega Water DNA Kit(Omega,USA)提取地下水樣品DNA。為減少實(shí)驗(yàn)誤差,做3次平行,完成DNA提取后用NanoDrop 2000超微量蛋白質(zhì)核酸分析儀(Thermo Fisher,USA)測(cè)定提取出的DNA濃度和純度后,混勻?yàn)?個(gè)樣品并置于-20 ℃條件下保存,用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。

1.4 PCR擴(kuò)增

將提取好的DNA產(chǎn)物使用16S rDNA V3～V4區(qū)引物(338F/806R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系總計(jì)20 μL,含4 μL的5X FastPfu緩沖液,2 μL的dNTPs(2.5 mmol·L-1),0.8 μL的正向引物(5 μmol·L-1),0.8 μL的反向引物(5 μmol·L-1),0.4 μL的FastPfu聚合酶,10 ng的DNA模板,補(bǔ)超純水至20 μL。PCR擴(kuò)增過(guò)程:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火溫度下反應(yīng)30 s,72 ℃延伸90 s,共25個(gè)循環(huán),最后72 ℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用w=2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè);根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用φ=2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,對(duì)目的條帶使用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen,Germany)回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.5 高通量測(cè)序

純化后的產(chǎn)物經(jīng)Hiseq PE250平臺(tái)(Illumina,USA)進(jìn)行高通量測(cè)序和分析。使用TruSeq?DNA PCR-Free樣品制備試劑盒(Illumina,USA)建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)使用Qubit @ 2.0熒光計(jì)(Thermo Scientific,USA)和Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(Agilent,USA)評(píng)估測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用Uparse軟件(版本為7.0.1001)進(jìn)行序列分析,基于有效數(shù)據(jù)劃分操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs),具有≥97%相似性的序列被分配給相同的OTU,篩選每個(gè)OTU的代表序?qū)Ρ萐ilva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)[19]。為研究不同OTU的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,以及不同樣本中優(yōu)勢(shì)種的差異,使用Muscle軟件(版本為3.8.31)進(jìn)行多序列比對(duì)。通過(guò)Qiime軟件(版本為1.7.0)計(jì)算地下水樣品Alpha多樣性指數(shù)[20]。環(huán)境因子與細(xì)菌群落的相關(guān)性研究首先經(jīng)除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析排序(detrended correspondence analysis,DCA),通過(guò)分析結(jié)果中第1軸的梯度長(zhǎng)度,選定冗余分析(redundancy analysis,RDA)提取顯著解釋細(xì)菌群落的環(huán)境因子[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水質(zhì)理化性質(zhì)分析

工業(yè)園區(qū)5口地下監(jiān)測(cè)井水質(zhì)的理化分析結(jié)果見(jiàn)表1和表2,在地下水樣品中共有12項(xiàng)一般化學(xué)指標(biāo)、5項(xiàng)天然背景離子,3項(xiàng)毒理學(xué)指標(biāo)和2項(xiàng)非常規(guī)毒理學(xué)指標(biāo)被檢出;其中,銅、鋅、鎘、1,2-二氯乙烯和三氯乙烯僅在G5點(diǎn)位被檢出。

表1地下水樣品的理化指標(biāo)、類別和綜合評(píng)價(jià)

Table1Physicalandchemicalproperties,categoriesandcomprehensiveevaluationofgroundwatersamples

樣品pH值ρ(總硬度)/(mg·L-1)ρ(硫酸鹽)/(mg·L-1)ρ(氯化物)/(mg·L-1)ρ(鐵)/(mg·L-1)ρ(錳)/(mg·L-1)ρ(銅)/(mg·L-1)ρ(鋅)/(mg·L-1)ρ(高錳酸鹽指數(shù))/(mg·L-1)測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別G17.23Ⅰ219Ⅱ44.8Ⅰ5.5Ⅰ0.15Ⅱ0.32ⅣNDⅠNDⅠ1.4ⅡG26.91Ⅰ301Ⅲ115.0Ⅱ35.8Ⅰ0.10Ⅰ0.06ⅢNDⅠNDⅠ0.9ⅠG36.92Ⅰ304Ⅲ44.8Ⅰ33.3Ⅰ0.06Ⅰ0.06ⅢNDⅠNDⅠ0.7ⅠG46.97Ⅰ224Ⅱ38.0Ⅰ4.0Ⅰ0.13Ⅱ0.72ⅣNDⅠNDⅠ1.8ⅡG56.75Ⅰ337Ⅲ95.6Ⅱ15.2Ⅰ0.10Ⅰ2.56Ⅴ0.001 5Ⅰ0.005 9Ⅰ0.8Ⅰ樣品ρ(氨氮)/(mg·L-1)ρ(鈉)/(mg·L-1)ρ(硝酸鹽)/(mg·L-1)ρ(氟化物)/(mg·L-1)ρ(鎘)/(mg·L-1)ρ(1,2-二氯乙烯)/(μg·L-1)ρ(三氯乙烯)/(μg·L-1)測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別測(cè)定值類別綜合評(píng)價(jià)最差類別指標(biāo) G10.066Ⅱ19.9Ⅰ0.041Ⅰ0.47ⅠNDⅠNDⅠNDⅠⅣ錳G2NDⅠ39.9Ⅰ0.049Ⅰ0.39ⅠNDⅠNDⅠNDⅠⅢ總硬度、錳G3NDⅠ19.4Ⅰ3.040Ⅱ0.30ⅠNDⅠNDⅠNDⅠⅢ總硬度、錳、G40.071Ⅱ13.1Ⅰ0.081Ⅰ0.72ⅠNDⅠNDⅠNDⅠⅣ錳G50.185Ⅲ30.4Ⅰ0.050Ⅰ0.20Ⅰ0.014 0Ⅴ0.8Ⅱ0.5ⅠⅤ錳、鎘

ND表示檢測(cè)結(jié)果低于方法檢出限：銅為0.001 0 mg·L-1,鋅為0.005 0 mg·L-1,氨氮為0.010 mg·L-1,鎘為0.000 1 mg·L-1,1,2-二氯乙烯為0.5 μg·L-1,三氯乙烯為0.5 μg·L-1。

根據(jù)地下水各指標(biāo)含量特征及限值進(jìn)行分類,參與地下水質(zhì)量評(píng)價(jià)的有16項(xiàng)(表1),其中7項(xiàng)指標(biāo)均為Ⅰ類,12項(xiàng)指標(biāo)均在Ⅱ類以內(nèi),錳和鎘在G5點(diǎn)位為Ⅴ類。根據(jù)GB/T 14848—2017[17]對(duì)地下水監(jiān)測(cè)井水質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),結(jié)果表明5口地下水監(jiān)測(cè)井綜合類別分別為Ⅳ、Ⅲ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ類,錳為所有采樣點(diǎn)最差類別指標(biāo)。

除參與地下水質(zhì)量評(píng)價(jià)的16項(xiàng)理化指標(biāo)外,地下水各采樣點(diǎn)的電導(dǎo)率、溶解氧及天然背景離子測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。電導(dǎo)率和溶解氧在各采樣點(diǎn)變化范圍分別為421～662 μS·cm-1和5.21～8.22 mg·L-1,鈣、鎂、鉀和碳酸氫根均以G5點(diǎn)位濃度最高。

表2地下水樣品的電導(dǎo)率、溶解氧及天然背景離子濃度

Table2Conductivity,dissolvedoxygenandnaturalbackgroundionconcentrationsofgroundwatersamples

樣品電導(dǎo)率/(μS·cm-1)ρ(溶解氧)/(mg·L-1)ρ(鈣)/(mg·L-1)ρ(鎂)/(mg·L-1)ρ(鉀)/(mg·L-1)ρ(碳酸氫根)/(mg·L-1) G14218.1446.513.20.46221 G26628.2275.620.70.36295 G36147.3277.419.20.66325 G44337.3268.311.113.10257 G56625.2182.926.630.40372

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性

經(jīng)高通量測(cè)序,地下水樣品共計(jì)得到403 355條高質(zhì)量基因序列,最終5個(gè)采樣點(diǎn)地下水樣品獲得注釋信息的基因總序列有392 956。在97%分類水平下,各個(gè)采樣點(diǎn)的OTUs分別為G1:1 260;G2:1 761;G3:1 834;G4:1 426和G5:1 244,將不同地下水樣品的OTU分布進(jìn)行Venn圖分析,以解釋不同樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的差異[22],結(jié)果見(jiàn)圖2。5個(gè)地下水樣品中均有分布的OTU數(shù)為362,共有OTU數(shù)最多的是G2和G3(1 300),最少的為G1和G3(120),表明G2和G3樣品細(xì)菌群落組成的同源性較高[23]。各樣品特有的OTU數(shù)從大到小依次為G3(292)、G2(290)、G4(236)、G5(138)和G1(128)。

稀釋曲線(圖3)表明各采樣點(diǎn)地下水樣品在有效測(cè)序數(shù)達(dá)到45 000時(shí),曲線漸進(jìn)平緩,GW2和GW3樣品在測(cè)序條數(shù)相同時(shí),所產(chǎn)生的OTU更多,實(shí)際各樣品用于OTU注釋的測(cè)序數(shù)為53 367～76 779,滿足后續(xù)測(cè)序要求[24]。稀釋曲線反映出各個(gè)采樣點(diǎn)聚類產(chǎn)生的OTUs為G3>G2>G4>G1>G5,這與圖2所述一致。同時(shí)反映各采樣點(diǎn)樣品OTU覆蓋率的Coverage指數(shù)均達(dá)到0.99以上(表3),可以證明測(cè)序效果較為理想。

通過(guò)描述群落豐富度、均勻度和多樣性的Alpha多樣性指數(shù)來(lái)解釋地下水細(xì)菌群落物種組成情況[25],由Shannon指數(shù)反映出各采樣點(diǎn)細(xì)菌群落多樣性和均勻度均為G2>G3>G4>G1>G5,由Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映出各采樣點(diǎn)細(xì)菌群落豐富度均為G3>G2>G4>G1>G5(表3)。G5點(diǎn)位的細(xì)菌多樣性和豐富度最低,這主要是由于G5點(diǎn)位化學(xué)組分含量高(表1～2)。

圖2 不同樣品OTU分布Venn圖

圖3 地下水樣品的稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curve of groundwater samples

表3Alpha多樣性指數(shù)

Table3Alphadiversityindex

樣品Coverage指數(shù)Shannon指數(shù)Chao1指數(shù)ACE指數(shù) G10.9935.2861 293.0651 400.437 G20.9957.2631 717.9301 740.266 G30.9946.9761 813.4321 834.773 G40.9946.3341 366.3491 426.384 G50.9945.2191 204.2781 290.204

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

注釋物種分類信息表明未能在門、綱、目、科、屬和種分類水平上進(jìn)行分類的基因序列比例分別為0.41%,1.37%,4.19%,6.49%,32.03%和90.99%。物種注釋結(jié)果表明地下水樣品共檢出55個(gè)細(xì)菌門,圖4為門分類水平下地下水各采樣點(diǎn)的菌群結(jié)構(gòu)。相對(duì)豐度最高的是變形菌門(Proteobacteria,86.40%),各采樣點(diǎn)Proteobacteria占比大小為G5>G1>G4>G3>G2。同時(shí)4類變形菌綱是地下水細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱,其中占比重較高的是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria,47.51%)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria,29.58%)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,6.75%),δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria,1.90%)平均相對(duì)豐度較低。擬桿菌門(Bacteroidetes,5.06%)和厚壁菌門(Firmicutes,3.04%)是平均豐度排名第2和第3的優(yōu)勢(shì)類群;其中Bacteroidetes和Firmicutes以G3點(diǎn)位相對(duì)豐度最高。此外,相對(duì)豐度較高的細(xì)菌門依次為浮霉菌門(Planctomycetes,0.64%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae,0.40%)、酸桿菌門(Acidobacteria,0.42%)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria,0.57%)和綠彎菌門(Chloroflexi,0.28%),將占比較低的細(xì)菌類群歸為其他類。

各采樣點(diǎn)屬分類水平菌群結(jié)構(gòu)有所差異,相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有13個(gè)。相對(duì)豐度排名前3的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分別為假單胞菌屬(Pseudomonas,16.38%),Perlucidibaca(9.17%)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter,8.12%),其中G1點(diǎn)位的Pseudomonas和Acinetobacter的占比較高,分別為25.49%和20.43%。該研究檢出的地下水細(xì)菌群落中共有564個(gè)細(xì)菌屬,除Pseudomonas、Perlucidibaca和Acinetobacter外,其余優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)豐度均低于4%。

Proteobacteria為地下水中最具優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類群,選取Proteobacteria中排名前15的細(xì)菌屬進(jìn)行物種分類(圖5),這些細(xì)菌屬均為地下水細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)類群。假單胞菌目(Pseudomonadales,38.76%)為相對(duì)豐度最高的細(xì)菌目,Pseudomonas、Perlucidibaca、Acinetobacter和Alkanindiges(2.41%)等細(xì)菌屬均隸屬于假單胞菌目。伯克氏菌目(Burkholderiales,22.74%)為地下水細(xì)菌群落中第2大優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目,馬賽菌屬(Massilia,3.60%)、湖沉積桿菌屬(Limnobacter,1.86%)、噬氫菌屬(Hydrogenophaga,0.63%)和極地單胞菌屬(Polaromonas,0.38%)均隸屬于伯克氏菌目。此外,紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)、黃單胞菌目(Xanthomonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)和嗜氫菌目(Hydrogenophilales)為地下水細(xì)菌群落排名前7的細(xì)菌目。

細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性結(jié)合Spearman秩相關(guān)和冗余分析進(jìn)行,圖6表明環(huán)境因子對(duì)地下水細(xì)菌群落具有一定影響(共選取5個(gè)地下水樣品中均檢出的16項(xiàng)理化指標(biāo))。冗余分析結(jié)果表明第1主軸對(duì)屬水平細(xì)菌群落方差變化的解釋量為61.50%,第2主軸的解釋量為23.30%,到軸4的累計(jì)合理解釋量為100%。其中氯化物、電導(dǎo)率、總硬度、鈉、鎂、硝酸鹽碳酸氫根、硫酸鹽、鈣和溶解氧與第1主軸和第2主軸都呈負(fù)相關(guān);鉀、鐵、錳和pH值與第1主軸和第2主軸都呈正相關(guān);高錳酸鹽指數(shù)和氟化物與第1主軸呈負(fù)相關(guān),與第2主軸呈正相關(guān)。

圖4 不同分類水平的地下水細(xì)菌組成

圖5 優(yōu)勢(shì)變形菌門物種分類樹Fig.5 Species classification tree of predominant Proteobacteria phyla

環(huán)境因子箭頭連線長(zhǎng)短代表該環(huán)境因子對(duì)物種數(shù)據(jù)的解釋量,箭頭連線越長(zhǎng),解釋量越大,反之越小;物種箭頭連線長(zhǎng)度代表該物種被解釋量,箭頭連線越長(zhǎng),被解釋量越大,反之越小;箭頭連線和排序軸以及箭頭連線之間的夾角表示兩者之間的相關(guān)性,夾角越小,相關(guān)性越大,反之越小。

經(jīng)分析,氯化物、鈣、電導(dǎo)率、鐵、氟化物和硫酸鹽是能顯著解釋細(xì)菌群落的環(huán)境因子,解釋量分別為0.306、0.256、0.220、0.215、0.207和0.201。其中,氯化物與鹽單胞菌屬(Halomonas,r=0.958,P<0.01)和鏈球菌屬(Streptococcus,r=0.932,P<0.05)呈顯著正相關(guān),與Polaromonas(r=-0.972,P<0.01)和氣單孢菌屬(Aeromonas,r=-0.929,P<0.05)呈顯著負(fù)相關(guān);鈣與Hydrogenophaga(r=-0.937,P<0.05)呈顯著負(fù)相關(guān);硫酸鹽與Perlucidibaca(r=0.961,P<0.01)呈顯著正相關(guān),與Massilia(r=-0.921,P<0.05)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas,r=-0.939,P<0.05)呈顯著負(fù)相關(guān)。同時(shí),氟化物、高錳酸鹽指數(shù)、鉀、鐵、錳和pH值對(duì)G1、G5和G4樣本的細(xì)菌群落影響較大,其余理化指標(biāo)對(duì)G2和G3樣本的細(xì)菌群落影響較大。

3 討論

地下水是地球上最主要且分布最為廣泛的水資源之一,而在人口較為密集、工業(yè)生產(chǎn)較為發(fā)達(dá)地區(qū)會(huì)由于受人類活動(dòng)干擾大而使地下水污染越來(lái)越嚴(yán)重[26]。不同的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生不同的功能效應(yīng),構(gòu)成整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換過(guò)程的基礎(chǔ)[27]。經(jīng)高通量測(cè)序,該工業(yè)園區(qū)地下水細(xì)菌群落中相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)類群有Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes,而這3類細(xì)菌類群在魚塘、河流及湖泊等多種淡水環(huán)境中占比豐富[28-30],表明該工業(yè)園區(qū)細(xì)菌群落具有典型的淡水種群特征。KADNIKOV等[31]對(duì)西西伯利亞深層地下含水層未培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行研究,結(jié)果表明:Firmicutes、Chloroflexi、Proteobacteri和Bacteroidetes為主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群,但優(yōu)勢(shì)細(xì)菌所占比重與該研究結(jié)果差異較大,主要是由于這兩處地下水理化性質(zhì)差異所致[32]。

γ-變形菌綱是工業(yè)園區(qū)地下水中豐度最高的細(xì)菌綱,這與BEYER等[32]關(guān)于地下含水層細(xì)菌群落的研究結(jié)果一致。γ-變形菌綱是目前所知的細(xì)菌中種類最多的一綱[33],而該研究中Pseudomonas、Acinetobacter和Perlucidibaca等優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬均隸屬于γ-變形菌綱。LI等[9]發(fā)現(xiàn)Acinetobacter,Pseudomonas、冷桿菌屬(Psychrobacter)和Alishewanella是高砷地下水中豐度最高的細(xì)菌屬,表明Pseudomonas在巖石地層單位中占據(jù)主導(dǎo)地位[32]。該研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas是工業(yè)園區(qū)屬分類水平上最具優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類群,屬化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型微生物,某些菌株能產(chǎn)生表面活性劑,有助于有機(jī)污染物的降解[34]。Acinetobacter主要分布在水體和土壤中[35],經(jīng)常在強(qiáng)還原性的地下水樣品中被檢出,被認(rèn)為具有還原能力[36];而在沉積物中占主導(dǎo)地位的氧化細(xì)菌Thiobacillus、Hydrogenophaga和土桿菌屬(Geobacter)[37-39]在工業(yè)園區(qū)地下水中也均有檢出,它們能在特定的環(huán)境中加速亞鐵離子的氧化,同時(shí)參與重金屬的氧化還原過(guò)程[38];推測(cè)這些具有特殊功能的細(xì)菌在地下水重金屬的遷移和轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到了一定的作用。

地下水含水層是較為極端的微生物棲息地,環(huán)境條件的差異會(huì)使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有所不同,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與所處的理化條件密切相關(guān)[40]。有研究表明地下水中的產(chǎn)黃菌屬(Flavobacterium)和Aeromonas與溶解性有機(jī)碳和鋇含量相關(guān),而Acinetobacter在硅和硝酸鹽濃度增加時(shí)占優(yōu)勢(shì)[32]。而砷、總有機(jī)碳、硫酸根離子和亞鐵離子是形成地下水微生物群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因素[9],但目前尚不清楚影響地下水微生物群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因素。該研究經(jīng)冗余分析發(fā)現(xiàn)影響工業(yè)園區(qū)地下水細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子為氯化物、鈣、電導(dǎo)率、鐵、氟化物和硫酸鹽,不同環(huán)境因子對(duì)不同細(xì)菌類群影響不同;同時(shí)不同點(diǎn)位細(xì)菌群落受環(huán)境因子的影響有所不同(圖6),研究表明微生物也會(huì)參與到地下水中各種化學(xué)物質(zhì)的氧化還原[9],可見(jiàn),微生物與地球化學(xué)過(guò)程之間的復(fù)雜相互作用維持著地下水環(huán)境細(xì)菌群落的生態(tài)平衡和物質(zhì)轉(zhuǎn)換。該研究以工業(yè)園區(qū)為背景,在水質(zhì)分析的基礎(chǔ)上研究不同點(diǎn)位細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性差異[41]。水質(zhì)分析結(jié)果表明該工業(yè)園區(qū)部分點(diǎn)位地下水受到不同程度的污染(表1),其中水質(zhì)情況較好的點(diǎn)位(G2和G3)地下水細(xì)菌群落豐富度和均勻度較高(表3)。G5位于園區(qū)北部(周邊建有化工、化肥和制藥等環(huán)境敏感源),化學(xué)組分含量相對(duì)較高,檢出特征指標(biāo):硝酸鹽、氟化物、鎘、1,2-二氯乙烯和三氯乙烯,水質(zhì)綜合類別為V類(表1和表2),其細(xì)菌群落豐富度和均勻度也最低(表1和表3),可見(jiàn)水質(zhì)情況影響著細(xì)菌群落組成和多樣性,這與WANG等[42]對(duì)太湖進(jìn)行不同污染源對(duì)細(xì)菌群落影響的研究結(jié)果一致。

綜上所述,通過(guò)Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)工業(yè)園區(qū)地下水細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes為主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門,其中Proteobacteria占據(jù)總基因豐度的86.40%(以γ-變形菌綱為主),工業(yè)園區(qū)地下水細(xì)菌群落呈現(xiàn)出典型的淡水種群特征。水質(zhì)情況影響著工業(yè)園區(qū)地下水細(xì)菌群落組成和多樣性,經(jīng)冗余分析發(fā)現(xiàn)氯化物、鈣、電導(dǎo)率、鐵、氟化物和硫酸鹽是能顯著解釋細(xì)菌群落的環(huán)境因子,不同環(huán)境因子對(duì)不同細(xì)菌類群和不同樣本的細(xì)菌群落影響有所不同。