吳順義，張曉蓉

(昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院正畸科，昆明 650106)

成骨可分為膜內成骨和軟骨內成骨，在膜內成骨中骨由成骨細胞直接形成，而在軟骨成骨中，軟骨細胞最初發(fā)展并最終被骨替代。Runx2是Runt家族成員之一，它們含有共同的DNA結合runt結構域，能與核心結合因子β(core binding factor beta，Cbfb)形成異二聚體，并與共有序列TGPyGGPyPy結合[1]。實驗證明在Runx2缺失小鼠中膜內和軟骨內骨形成被完全中斷，最終表現為骨骼和軟骨樣骨完全缺失[2]。Runx2能誘導間充質細胞的分化，并使間充質細胞向成骨細胞方向分化，抑制脂肪細胞和軟骨細胞分化。Runx2在軟骨發(fā)育中也起重要作用，并引導軟骨中血管的形成和侵入。小鼠中Runx2的雜合突變會導致與人類顱骨鎖骨發(fā)育不全綜合征相似的表型，其表現為身材矮小、鎖骨發(fā)育不全、多生牙和囟門不能閉合，并且已經有報道具有顱骨鎖骨發(fā)育不全綜合征的患者Runx2發(fā)生突變[3]。以上都證明Runx2在骨形成、軟骨形成、骨代謝相關疾病方面有著重要作用，現對Runx2自身轉錄、在成骨細胞和軟骨細胞的分化的調控作用以及在骨關節(jié)炎發(fā)病機制方面的作用進行綜述。

1 Runx2基因的轉錄調控

Runx2轉錄自遠端P1和P2啟動子，具有兩個不同的亞型，Ⅰ型Runx2起始序列MRIPV轉錄自P2啟動子，Ⅱ型Runx2起始序列MASNS轉錄自P1啟動子[4]。Ⅰ型和Ⅱ型Runx2都能在成骨細胞系細胞和軟骨細胞中表達，但Ⅱ型Runx2主要在成骨細胞中表達。盡管Ⅰ型Runx2比Ⅱ型Runx2更加依賴Cbfb，但Ⅰ型和Ⅱ型Runx2在軟骨細胞和成骨細胞中具有相似的功能。兩種亞型都是骨骼發(fā)育所必需的，其中一種亞型缺失都將造成小鼠軟骨內成骨和膜內成骨結構嚴重受損。研究發(fā)現Ⅰ型Runx2第一個停止密碼子的ATG突變，其表達蛋白沒有明顯差異，說明Ⅰ型Runx2的N端氨基酸在生理功能上并不重要，在骨骼發(fā)育中P1和P2啟動子對Runx2表達的調控可能比兩種亞型的功能差異更重要[5]。

P1啟動子已被廣泛檢測，體外實驗證明Fosb/Jund、Tcf7/Ctnnb1、Sp1/Elk1、Dlx5、Msx2、Hoxa10能與P1啟動子近700 bp區(qū)域結合，從而激活或抑制P1啟動子的活性[6]。體內分析，P1啟動子控制下的小鼠Runx2基因能在不成熟軟骨細胞中表達，不能在成骨細胞和成熟軟骨細胞中表達。在使用Runx2位點200 kb細菌人工染色體克隆的實驗小鼠中發(fā)現，該基因在成骨細胞和軟骨細胞中以與野生型小鼠相似的模式表達，因此，Runx2在成骨細胞和軟骨細胞中的表達受增強子的調控。位于P1啟動子上游的增強子已經被識別，例如，增強子的343 bp區(qū)域與最小啟動子Hsp68結合，指導專門針對在成骨細胞中Runx2表達；增強子Dlx5/6和Mef2直接與89 bp核心序列結合，通過蛋白與蛋白相互作用，與Tcf7、Ctnnb1、Sp7(serine protease 7)、Sox5/6、Smad1形成增強體，增強體強烈激活增強子。但是89 bp核心序列中同源框或Mef2的突變在體內和體外均可消除增強子活性[7]。

2 Runx2對間充質細胞分化的作用

Runx2能調控印度豪豬蛋白(Indian hedgehog,Ihh)的表達，并與Sp7和經典Wnt傳導相互調控，調控間充質細胞向成骨細胞方向分化，并抑制脂肪細胞和軟骨細胞分化。

2.1Ihh與骨發(fā)育 Ihh缺失小鼠出生后不久即死去，軟骨膜形成受損，軟骨膜中無Runx2的表達[8]，說明成骨細胞分化需要Ihh，軟骨內骨發(fā)育需要Runx2的表達。在Col2a1啟動子環(huán)化重組酶轉基因小鼠中，環(huán)化重組酶不僅在軟骨細胞中表達，而且在軟骨膜中也表達。使用Col2a1啟動子環(huán)化重組酶轉基因的Ihh條件敲除小鼠，小鼠在出生后不久就死亡，骨不形成，而且包括Runx2在內的成骨標記基因在肢體骨中無表達[9]。然而，使用Prrx1啟動子環(huán)化重組酶轉基因的Ihh條件敲除小鼠，雖然小鼠四肢骨骼的形成嚴重受損，Runx2在成骨細胞中的表達水平不到野生型小鼠的一半，但出生后能夠存活，并且環(huán)化重組酶在四肢和顱骨間充質細胞中表達[10]。以上說明Ihh在骨發(fā)育中具有重要作用，Ihh的缺失會引起骨發(fā)育的嚴重受損。此外，Hedgehog(Hh)信號通路與其受體蛋白ptch結合可緩解精胺氧化酶的抑制作用，最終調控醇溶蛋白的生成。在使用Col2a1啟動子環(huán)化重組酶的精胺氧化酶條件敲除小鼠中，Runx2表達在軟骨膜外表達而不在軟骨膜內表達，軟骨膜細胞不能分化成軟骨細胞、骨髓。因此，在軟骨膜和骨髓中，Runx2的表達和骨形成需要Hh信號通路。Ihh還會影響骨形成的位置，在使用Col2a1啟動子環(huán)化重組酶轉基因的Ihh條件敲除小鼠中，Ihh參與了顱骨的發(fā)育，但是在顱骨中的表達比四肢骨中少[11]。使用Sp7啟動子環(huán)化重組酶轉基因的Ihh條件敲除小鼠骨發(fā)育正常，此實驗證明Ihh僅在成骨細胞分化的早期起作用，而成骨細胞的終末分化則不需要Ihh。Hh信號通路誘導Runx2表達的機制尚未得到驗證，但Hh信號通路確實能誘導Runx2表達。

2.2Runx2與間充質細胞 Runx2缺失小鼠，成骨細胞完全缺失、間充質細胞少。在成骨細胞誘導培養(yǎng)中，Runx2缺失顱骨細胞可分化為脂肪細胞和軟骨細胞，但是成骨細胞中不存在骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，說明Runx2缺失顱骨細胞具有向脂肪細胞和軟骨細胞分化的能力[12]。此外,Runx2能抑制脂肪的形成，引進Runx2可防止脂肪細胞的分化，Runx2缺失軟骨細胞會自發(fā)分化成脂肪細胞。與此相反，過氧化物酶體增殖物激活受體γ編碼基因可以通過物理相互作用抑制Runx2功能，抑制成骨細胞分化；實驗證明利用Prrx1啟動子早期啟動間充質細胞Runx2表達可誘導成骨細胞分化并且抑制軟骨細胞分化[13]。因此，Runx2在決定多能間充質細胞分化中起著至關重要的作用，其表達促進成骨細胞的分化，抑制脂肪細胞和軟骨細胞的分化。

2.3Sp7與骨發(fā)育 Sp7在骨發(fā)育過程中也具有重要作用，Sp7缺失小鼠成骨細胞完全缺失，而間充質細胞豐富，可分化為軟骨細胞。此外，實驗發(fā)現Sp7缺失小鼠Runx2能在間充質細胞中表達，從而說明Runx2是Sp7的上游基因，能直接調節(jié)Sp7表達[14]。經典的Wnt信號對成骨細胞分化也至關重要，在敲除Ctnnb1基因的小鼠中，Ctnnb1基因在成骨細胞和軟骨細胞的祖細胞中被敲除，Runx2在軟骨膜中表達，但在成骨細胞中完全缺失，Sp7在這些小鼠中表達缺失，軟骨膜間充質細胞和顱骨間充質細胞分化為軟骨細胞,類似于Sp7缺失小鼠。使用Col2a1或Prrx1啟動子環(huán)化重組酶Ctnnb1基因敲除小鼠也表現出相似的表型。以上說明，骨祖細胞仍具有向成骨細胞和軟骨細胞分化的能力，Sp7和經典Wnt信號抑制軟骨細胞分化，并使骨祖細胞直接向成骨細胞分化。此外，Sp7和Tcf7/Ctnnb1調控Runx2的增強子活性[15]。因此，Runx2、Sp7和經典Wnt傳導相互調控，使間充質細胞向成骨細胞方向分化，并抑制脂肪細胞和軟骨細胞分化。大量的成骨細胞祖細胞存在于Sp7缺失小鼠和Ctnnb1基因缺失小鼠,而不存在于Runx2缺失小鼠，說明Runx2是骨祖細胞分化所必需的。與此相反，Notch信號通路可通過誘導與Runx2相互作用的轉錄抑制因子Hes和Hey蛋白來抑制Runx2的功能，從而抑制多能間充質細胞向成骨細胞分化，Notch信號還能促進多能間充質細胞增殖[16]。

3 Runx2在成骨細胞分化中的作用

利用2.3 kb Col1a1啟動子過表達Runx2，初步檢測Runx2在成骨細胞分化中的功能。實驗發(fā)現使用該啟動子的Runx2轉基因小鼠出現骨質疏松和多處骨折，成骨細胞成熟受到抑制，皮質骨呈現編織骨結構，骨吸收增強[17]。Runx2在成骨細胞祖細胞中表達，在成骨細胞未成熟時表達量最高，成骨細胞成熟時表達量下降[18]。然而，2.3 kb Col1a1啟動子在成骨細胞中是活躍的，其活性在成熟成骨細胞中也較活躍，以上研究結果表明成骨細胞中強表達的Runx2抑制成骨細胞成熟[19]。因此，Runx2在成骨細胞早期分化中起促進作用，在成骨細胞的成熟過程中起抑制作用。此外研究證明皮質骨的骨吸收增強是由Runx2誘導的Tnfsf11基因的過表達和Tnfrsf11b基因抑制引起的，皮質骨中骨細胞嚴重減少，提示Runx2負性調控成骨細胞向骨細胞的轉化。使用2.3 kb Col1a1啟動子過表達Sp7也會導致骨形成減少、骨質減少。然而，成骨細胞向骨細胞的轉化并未受抑制[20]。

使用在2.3 kb Col1a1啟動子環(huán)化重組酶轉基因的Runx2條件敲除小鼠，進一步檢測Runx2在成骨細胞分化中的功能。實驗發(fā)現Runx2的成骨細胞特異性缺失，其中Runx2外顯子4缺失的小鼠成骨細胞分化沒有表現出明顯的差異，外顯子4缺失的Runx2編碼了與Cbfb進行DNA結合的異二聚所必需的runt區(qū)域的一部分[21]。然而，具有成骨細胞特異性的小鼠若Runx2外顯子8缺失，會因骨形成減少而出現骨質疏松癥，Runx2外顯子8缺失會產生一種不被截斷的Runx2蛋白[22]。雖然外顯子4缺失和外顯子8缺失小鼠均使用來自相同來源的2.3 kb Col1a1啟動子環(huán)化重組酶轉基因小鼠，但不能保證環(huán)化重組酶的表達水平相同,此外，兩組環(huán)化重組酶轉基因小鼠的背景不同,因此環(huán)化重組酶的不同背景或表達水平可能導致表型的差異。缺失外顯子8的截斷蛋白保留了轉錄激活的能力，其活性低于野生型Runx2[23],當截斷的蛋白轉移到細胞核并與Runx結構域結合時，可能會干擾Runx家族所有蛋白的功能。使用在2.3 kb Col1a1啟動子控制下的環(huán)化重組酶轉基因小鼠有條件地敲除Runx3也會導致骨質疏松,進而說明Runx2和Runx3在成骨方面具有相似的功能[24]。但是，Runx2在分化成骨細胞中的詳細作用尚需進一步研究。

4 Runx2在軟骨細胞中的作用

野生型小鼠的生長板由休眠層、增殖層、前肥大層、肥大層和終末肥大層共5層軟骨細胞組成，軟骨細胞在休眠層和增殖層中活躍增殖，進一步分化為失去增殖能力的肥大軟骨細胞。休眠和增殖層軟骨細胞表達Col2a1，開始成熟的前肥大軟骨細胞表達甲狀旁腺激素受體和Ihh，肥大軟骨細胞表達Ihh和血清X型膠原α1鏈，終末肥大軟骨細胞表達血清骨橋素、結合涎蛋白、基質金屬蛋白酶13和血管內皮生長因子A[25]。終末肥大軟骨細胞層發(fā)生血管侵犯，生長板逐漸被骨所取代。Runx2在休眠和增殖軟骨細胞層中表達較弱，在肥大前軟骨細胞層中表達上調，在肥大和終末肥大軟骨細胞層中表達進一步上調，以上研究說明Runx2在軟骨的成熟中發(fā)揮重要作用。

Runx2缺失小鼠骨骼由軟骨組成，軟骨細胞成熟紊亂。在大多數軟骨骨骼中，血清X型膠原α1鏈的表達嚴重降低，最終包括脛骨、腓骨、橈骨和尺骨在內的受限骨骼部位，出現肥大軟骨細胞層礦化基質[26]。Runx2在體外正向調節(jié)軟骨細胞的成熟，軟骨細胞Runx2的過表達加速軟骨細胞的成熟和軟骨內成骨過程，Runx2的表達減少則減慢軟骨細胞的成熟和軟骨內成骨過程。在Runx3缺失小鼠軟骨細胞成熟略推遲,Runx2缺失小鼠整個骨架完全阻塞。因此，Runx2和Runx3對于軟骨細胞的成熟必不可少，Runx2起主要作用，Runx3起次要作用。在前肥大軟骨細胞中，Runx2還能通過調控Ihh的表達，誘導甲狀旁腺激素樣激素的表達，進而抑制Runx2的表達和軟骨細胞的成熟，形成負反饋調節(jié)[27]。在肥大軟骨細胞中，Runx2通過激活增強子調控血清X型膠原α1鏈的表達。在終末肥大軟骨細胞中，Runx2調控血清骨橋素、結合涎蛋白、基質金屬蛋白酶13和血管內皮生長因子A的表達。Runx2還與Sp7相互作用，誘導基質金屬蛋白酶13的表達，Runx2缺失小鼠完全不能通過Runx2誘導血管內皮生長因子A調控血管侵入到軟骨[28]。所以，Runx2在軟骨發(fā)育過程中是必需的，除能在前肥大軟骨細胞、肥大軟骨細胞、終末肥大軟骨細胞等層次發(fā)揮重要作用外，還在血管侵入軟骨中起決定作用。

5 Runx2與骨關節(jié)炎

細胞黏合素主要在永久性軟骨的軟骨細胞中表達，促進關節(jié)軟骨細胞進入軟骨內成骨，軟骨細胞中Runx2過表達的小鼠，關節(jié)軟骨細胞中細胞黏合素缺失，在軟骨細胞中過表達的Runx2，明顯抑制小鼠所有軟骨的軟骨細胞中細胞黏合素的表達，因此，Runx2可通過調控細胞黏合素的表達影響軟骨細胞的分化。此外，Runx2誘導基質金屬蛋白酶13和基質金屬蛋白酶5的表達，破壞關節(jié)軟骨基質。研究證明成年小鼠軟骨細胞中Runx2的敲除可以減弱實驗性骨關節(jié)炎小鼠模型中骨關節(jié)炎的進展[29]。Runx2和轉錄因子Cebpb協(xié)同誘導骨關節(jié)炎發(fā)育和基質金屬蛋白酶13表達[30]。Runx2和基質金屬蛋白酶13陽性細胞數量在人骨關節(jié)炎軟骨軟骨細胞中呈上升趨勢，Runx2通過促分裂原活化的蛋白激酶信號通路增強成纖維細胞生長因子2通路誘導的基質金屬蛋白酶13的表達。SIRT1(sirtuin-1)是一種NAD依賴脫乙酰酶，在人骨關節(jié)炎軟骨的軟骨細胞中表達，調控Runx2和基質金屬蛋白酶13的表達[31]。既往研究報道組蛋白去乙?；?水平降低，人類骨關節(jié)炎軟骨中Runx2、Ihh、基質金屬蛋白酶13、血清X型膠原α1鏈的表達增加，Runx2、Ihh、基質金屬蛋白酶13、血清X型膠原α1鏈、基質金屬蛋白酶4、基質金屬蛋白酶5的表達與組蛋白去乙?；?的量呈負相關[32]。此外，Runx2基因位點中的兩個單核苷酸位點已被確定為骨關節(jié)炎易感位點[33]，目前公認的軟骨細胞的成熟參與了骨關節(jié)炎的發(fā)病機制，其中Runx2是致病基因之一。

6 Cbfb對Runx2的調控

研究表明Cbfb缺失小鼠會由于胎肝造血功能缺失而死亡，同時小鼠Runx2也缺失,表明Runx2表達需要Cbfb的參與,通過治療Cbfb缺失小鼠有缺陷的造血作用延長其生存時間，從而證明Cbfb是骨骼發(fā)育、Runx2的有效DNA結合和Runx2的轉錄激活能力所必需的[34]。使用Sp7環(huán)化重組酶轉基因小鼠、Col2a1環(huán)化重組酶轉基因小鼠、Prrx1環(huán)化重組酶轉基因小鼠和Twist2環(huán)化重組酶轉基因小鼠條件敲除Cbfb，發(fā)現Cbfb是軟骨細胞增殖、成熟和成骨細胞分化所必需的[35]。此外，Cbfb通過抑制泛素化介導的降解，在Runx蛋白的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。然而，不同Runx家族蛋白對Cbfb的依賴程度不同[36]，在顱骨和四肢軟骨組織中依賴水平為Runx1>Runx3>Runx2，肢體軟骨組織中的依賴水平高于顱骨。在Cbfb條件基因敲除使用Twist2 Cre敲入小鼠，Runx2缺失小鼠顱骨和鎖骨的發(fā)育受到嚴重干擾。然而,正常小鼠中Cbfb敲除其軟骨內骨化只是嚴重延遲。因此，Cbfb對軟骨內骨化的作用大于膜內骨化作用，膜內骨化相對軟骨內骨化更需要Runx2參與[37]。

Cbfb通過選擇性剪接形成Cbfb1和Cbfb2兩個功能異構體，Cbfb1缺失小鼠Cbfb2上調,而Cbfb2缺失小鼠Cbfb1不存在,表明Cbfb1受Cbfb2的控制，而Cbfb1對軟骨細胞和成骨細胞的分化以及Runx2的DNA結合更為有效[38]。因此，兩種亞型都具有不同效率的拮抗功能，能調節(jié)Runx2到合適的生理水平，從而在骨骼發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

7 小 結

骨代謝過程中Runx2、Sp7、Ihh、Wnt信號相互調節(jié)，引導多能間充質細胞向成骨細胞分化，抑制脂肪細胞和軟骨細胞分化。與此同時，Runx2是軟骨細胞成熟所必需的，Runx2和Ihh共同調節(jié)軟骨細胞的增殖和成熟。Runx2通過調節(jié)成骨細胞的分化來增強骨形成，而通過降解引起骨關節(jié)炎，是骨關節(jié)炎的重要病因機制之一。綜上所述，Runx2在骨代謝中發(fā)揮重要作用，是骨關節(jié)炎形成的重要基因之一。Runx2是成骨細胞和軟骨細胞分化的關鍵轉錄因子，其在轉錄和蛋白水平上的家族特異性調控對于骨質疏松癥和骨關節(jié)炎的治療具有重要意義。