李 婧，王懷明

(解放軍第八九醫(yī)院骨科實驗室，山東 濰坊 261021)

創(chuàng)傷或疾病導致的大段骨缺損仍是矯形外科面臨的重要難題之一。骨組織工程技術(shù)是促進骨再生、修復骨缺損的重要方法，也是攻克這一難題的希望。骨組織工程血管化在骨再生和骨缺損修復中的重要性一直都是研究熱點[1-2]。血管系統(tǒng)在骨發(fā)育、再生和重塑中不可或缺。骨再生的關(guān)鍵在于快速恢復血管系統(tǒng)，實現(xiàn)合適的血液供應，從而促進骨整合和骨缺損的修復[3-5]。骨組織工程技術(shù)一般由生物材料支架、生物活性因子及移植細胞3個基本單元組成，其中生物材料支架是核心，為骨缺損部位提供機械穩(wěn)定性，還可作為生物活性因子及移植細胞的轉(zhuǎn)運載體，是實現(xiàn)生物活性因子時空調(diào)控和動態(tài)影響血管重新生成的關(guān)鍵組分。從材料組成、表面功能化、機械性能及裝配技術(shù)等方面構(gòu)建和修飾生物材料，可進一步促進生物材料與生物活性因子以及移植細胞的協(xié)同作用，有利于血管生成應答的產(chǎn)生[6-8]?，F(xiàn)就近年來生物材料促進骨組織工程血管化的研究進展予以綜述。

1 改進材料組分促進血管生成

1.1生物活性玻璃(bioactive glasses,BGs) 可刺激血管化骨生長是生物材料支架完全替代骨移植的前提。BGs是較為理想的材料，其在生物醫(yī)學中的應用已被廣泛研究[9-11]。BGs本身較脆，但具備骨組織工程所必需的重要特點。BGs具有骨傳導性，可比其他生物陶瓷更快地與宿主組織鍵合，并在交界處形成羥磷灰石樣表層，類似于骨的礦物質(zhì)成分，從而與活體骨和組織結(jié)合更加牢固。BGs降解后釋放的溶出產(chǎn)物能在遺傳水平刺激成骨祖細胞，促進成骨作用[12]。此外，有研究顯示BGs能促進血管生成，對骨再生中新血管形成和軟組織損傷愈合十分重要，可以替代昂貴的促血管生成因子的應用。Lee等[13]將BGs納米顆粒融入磷酸鈣水泥中，發(fā)現(xiàn)隨著納米顆粒濃度的增加，細胞黏附、增殖和分化能力增強，并能激活一系列血管生成相關(guān)基因的表達，顯著影響內(nèi)皮細胞的遷移和血管形成。與磷酸鈣材料相比，BGs在燒結(jié)過程中發(fā)生結(jié)晶作用，不易制成多孔性結(jié)構(gòu)是限制其應用于臨床的重要原因，而多孔性支架是促進血管生成的重要因素。以往的研究主要是改進機體對BGs的應答，使其作用更廣泛。通過調(diào)整BGs組分可以預防結(jié)晶形成，可制備BGs與聚合材料的復合體或采用新型加工過程，使BGs材料更堅硬，從而制備出不同機械性能的支架，用于不同負重骨的替代治療。Midha等[14]研制的由70%二氧化硅和30%氧化鈣組成的BGs多孔支架可被破骨細胞重塑；從該支架中釋放的可溶性二氧化硅和鈣離子能使成骨細胞數(shù)量增加，且材料表面能支持內(nèi)皮細胞生長和血管形成，具備致血管生成潛力。因硼酸鹽BGs降解速率可控，作為移植物可以更好地匹配新骨形成速率，故研究者也嘗試用硼酸鹽或硼硅酸鹽復合物代替硅酸鹽構(gòu)建新型BGs材料，提高新骨形成能力。此外，BGs中還可以摻入銅、鋅、鍶等微量元素，更有利于健康骨的生長；或者用2%或5%的鈷離子替代部分鈣離子，可制備出模擬低氧的BGs使接種的骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)中低氧誘導因子和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因表達增加，并且能分泌VEGF[15]。

1.2產(chǎn)氧生物材料 氧氣不足是工程化組織中細胞死亡或功能喪失的主要原因，不可避免地導致移植后血管生成延遲，故應設法提高移植物中氧氣水平，尤其是早期移植階段和血管網(wǎng)絡形成之前，可同時維持細胞活力。生物材料本身具備理想的產(chǎn)生氧氣能力，無需多次手術(shù)，在移植后立即提供足夠的氧氣。例如無機過氧化物(如過碳酸鈉、過氧化鈣和過氧化鎂等)浸泡過的生物材料在體內(nèi)可通過水解作用直接產(chǎn)生氧氣[16]。Harrison等[17]合成了一種包含過碳酸鈉的乳酸羥乙酸多聚物(lactic-co-glycolic acid，PLGA)膜，將該膜移植到小鼠皮瓣上，1周內(nèi)組織壞死和細胞凋亡顯著減少。但PLGA膜可水解降解，無法調(diào)控氧氣產(chǎn)生速率且以過氧化氫作為媒介，而高濃度過氧化氫對細胞及周圍組織有害，故仍需補充過氧化氫酶來緩解細胞毒性，因此不能作為良好的對自由基敏感的細胞載體。Shiekh等[18]制備了含有過氧化鈣和抗氧化劑的聚氨酯支架，能持續(xù)釋放氧氣達10 d，并可減少自由基的產(chǎn)生，可維持細胞在低氧狀態(tài)下存活，防止組織壞死。Pedraza等[19]嘗試將固體過氧化鈣包埋在高度疏水性且穩(wěn)定的聚二甲基硅氧烷中，通過限制水進入生物材料實現(xiàn)對氧氣產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。聚二甲基硅氧烷的氧擴散和滲透性極高，可保證氧氣有效地從材料中擴散并進入周圍環(huán)境中。體外研究顯示，該材料可顯著緩和低氧誘導的細胞死亡和功能喪失，并限制細胞應激通路的活化和無氧代謝的轉(zhuǎn)化，在未使用任何自由基清除劑或過氧化物清除劑的前提下，維持細胞存活達3周。

1.3生物材料表面功能化 生物材料表面直接與周圍環(huán)境接觸，材料的表面能量、電荷及粗糙度等性質(zhì)決定了兩者的相互作用。對生物材料表面進行特定地修飾可賦予生物材料親水性、生物識別、細胞相容性等特質(zhì)，提高在生物環(huán)境中支架材料、生物活性因子和細胞的交叉作用效果，有利于組織再生。表面功能化的方法主要有以下幾種：①共價結(jié)合細胞黏附配體，通過配體與相應受體之間特異的相互作用提高機體獲得有效應答的能力。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸寡肽序列是常用的黏附配體，既可提高細胞的黏附增殖，又可結(jié)合生物活性因子。②選擇特定的功能基團或生物分子固定在材料表面，通過調(diào)節(jié)親水性/疏水性的平衡提高材料界面與周圍環(huán)境的趨近性。③表面磷酸化是表面功能化的有效方法，有利于骨鍵合，促進新骨形成。羧基、磷酸基團、氨基、羥基等陰離子功能團對生物材料表面的修飾能誘導磷酸鈣相的成核作用和羥磷灰石的生長。隨著對細胞和材料間相互作用機制研究的進一步深入，有學者提出了智能界面或智能支架等概念，通過多種途徑和方法精確合成生物材料，使其呈現(xiàn)高度特異空間分布的生物活性位點和理想的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而激發(fā)獨特的細胞應答，比傳統(tǒng)材料更有利于原位誘導成骨細胞分化及促進血管生成[20-22]。

2 調(diào)控促血管生成因子釋放

生物材料作為生物活性因子的載體，在行使轉(zhuǎn)運功能的同時，可從時間和空間上調(diào)控生物活性因子在體內(nèi)的定位及活性，參與促血管生成作用和成骨作用，對獲得更好的治療效果十分重要。生物活性因子可通過物理包裹或化學固定的方式加載到生物材料上。生物材料可通過特定修飾適應不同因子的需要，兼容不同釋放機制智能調(diào)控生物活性因子的體內(nèi)功能[23]。

2.1擴散釋放 擴散釋放一般采用物理包裹的方式轉(zhuǎn)運生物活性因子。根據(jù)操作的難易程度分為濃度梯度釋放和序貫釋放。濃度梯度釋放易于操作，將生物材料支架在生物活性因子溶液中浸泡至飽和后立即植入生物體內(nèi)或?qū)⑸锘钚砸蜃影裨诓牧现?，移植后生物活性因子沿濃度梯度快速脫離支架，擴散進入周圍組織。其釋放動力學取決于生物材料與生物活性因子之間的非特異性相互作用以及材料的孔隙大小、結(jié)構(gòu)和降解性。這些方法在早期報道的實驗結(jié)果中被證明可實現(xiàn)骨修復。通過調(diào)節(jié)孔徑大小等方式可更加精細地構(gòu)建材料支架，制備不同活性因子與材料的配對組合，實現(xiàn)特定生物活性因子的快速釋放，但釋放時間和空間定位方面難以調(diào)控。移植初期活性因子一次性突然釋放，難以實現(xiàn)大多數(shù)情況下需要生物活性因子持久釋放的目的，對于半衰期較短的生物活性因子，有時需要提高初始劑量，但會增加不良反應的產(chǎn)生風險。

血管形成是由一系列事件構(gòu)成的，成熟血管網(wǎng)絡形成需要許多促血管生成因子的精確調(diào)控才能實現(xiàn)。除了定向轉(zhuǎn)運一種生物活性因子外，同時或序貫轉(zhuǎn)運多種因子將會提高治療效果。有研究者嘗試將生物活性因子包裹在可降解微粒中，制成納米膠囊，來實現(xiàn)生物活性因子的序貫釋放。Perez等[24]以膠原蛋白為核心、藻酸鹽為外殼，設計了一種水凝膠纖維支架。將骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenic protein 2，BMP-2)加載于核心層，鈷離子加載于外殼中，并且根據(jù)需要可以靈活調(diào)整鈷離子濃度。結(jié)果表明，在血管生成中發(fā)揮作用的鈷離子在1周內(nèi)快速釋放，為早期血管生成創(chuàng)造條件。而成骨因子BMP-2則可以在幾周至幾個月的時間內(nèi)持續(xù)釋放。Bai等[25]利用超臨界二氧化碳發(fā)泡技術(shù)制備了一種新型聚合物系統(tǒng)，可以序貫轉(zhuǎn)運VEGF、成纖維生長因子2(fibroblast growth factor 2, FGF-2)和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)三種參與血管形成的因子，可從劑量和速率方面調(diào)控 3種因子的釋放，并顯著增強內(nèi)皮細胞的致血管生成作用以及成熟血管網(wǎng)絡的快速形成。

2.2降解釋放 生物材料的降解動力學直接決定了所轉(zhuǎn)運生物活性因子的釋放動力學。水解和酶解是生理條件下兩種主要降解方式。生物材料的分子量、聚合物的濃度和疏水性、交聯(lián)度、膨脹度、pH變化、機械壓力或拉伸作用等因素均能影響材料的降解。水解作用能以相同速率在機體不同部位發(fā)生，故難以實現(xiàn)時空上的精確調(diào)控。利用細胞分泌酶的活性可實現(xiàn)生物活性因子的特定釋放。在生理條件下，血管損傷后血小板、中性粒細胞和巨噬細胞迅速到達損傷部位，形成富含纖維蛋白的臨時基質(zhì)，其中包埋著生長因子。當基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)發(fā)揮作用降解臨時基質(zhì)時，結(jié)合在細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)上的生長因子即被釋放，用來調(diào)控周圍細胞的切口愈合和局部血管的重新形成。酶的局部濃度決定了酶解的結(jié)果，在時空上調(diào)節(jié)ECM的降解和存在，從而調(diào)控周圍環(huán)境中生長因子的濃度。根據(jù)這一生物激活策略構(gòu)建模擬ECM的生物材料支架，通過對局部環(huán)境信號或外源性刺激產(chǎn)生應答，能夠適當控制促血管生長因子在骨缺損部位的存在，實現(xiàn)按需釋放。有研究顯示，MMPs敏感性水凝膠可顯著提高BMP-2修復大鼠顱骨缺損的效果[26-27]。合成的MMPs敏感性水凝膠較目前臨床上使用的可吸收膠原海綿在加載BMP-2修復臨界大小骨缺損方面的效果更好。用MMPs配體功能化生物材料偶聯(lián)促血管生成因子，可按需釋放因子，誘導血管生成[28-29]。

2.3延緩釋放 在許多組織再生應用中，再生區(qū)域細胞持續(xù)暴露于含有特定可溶性活性因子的微環(huán)境并發(fā)生特定的細胞行為或形態(tài)發(fā)生事件，導致生物活性因子的持續(xù)呈遞，促進新組織生長。生物活性因子以一定速率的持久釋放，既可減少初始劑量、降低不良反應發(fā)生率，又可保證生物活性因子在整個修復過程中始終以適當濃度發(fā)揮作用。主要方式：①依靠親和力和非共價結(jié)合力(靜電作用、氫鍵、范德華力或疏水性作用等)，實現(xiàn)因子的持久釋放。用于骨組織再生的常用生物活性因子(BMP-2、FGF-2和VEGF)在生理pH條件下帶正電荷，可以與帶負電荷的生物材料形成多離子復合物。這種靜電作用可延緩生物活性分子的擴散，成為建立可調(diào)控轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的基礎(chǔ)。同樣，在生理pH下帶負電荷的DNA常與陽離子復合物結(jié)合形成帶正電荷的顆粒，從而延緩DNA從帶電荷生物材料基質(zhì)中釋放。②利用生物活性因子與肝素及其衍生物的親和作用構(gòu)建延緩釋放系統(tǒng)。存在于ECM中的肝素是富含負電荷的硫酸化分子，能結(jié)合多種促血管生成因子和成骨生長因子(如BMP-2、PDGF、FGF-2和VEGF)。利用工程技術(shù)將肝素結(jié)合域共價結(jié)合在支架材料上，通過親和作用調(diào)控生物活性因子的釋放和活性[30-31]。故可對某些生物材料進行硫酸化修飾，賦予其結(jié)合生物活性因子的能力，使其具有與肝素相同或更高的親和力，增強生物活性因子介導的體內(nèi)血管生成作用。Janse van Rensburg等[32]利用肝素共價修飾聚乙二醇凝膠可持續(xù)釋放肝素，其血管形成能力優(yōu)于不含肝素和非共價結(jié)合肝素的聚乙二醇凝膠，并能顯著增強生長因子的血管形成能力。Freeman等[33]研究硫酸化修飾對藻酸鹽支架轉(zhuǎn)運的促血管生成因子作用的影響，結(jié)果表明，硫酸化藻酸鹽支架組的血管密度和成熟血管比例較對照組高3倍以上。

3 調(diào)節(jié)材料強度促進細胞定向分化

干細胞具有多能性，是骨組織工程中常用的移植細胞。除生化信號外，干細胞的維持和分化也受到微環(huán)境中生物物理因素的調(diào)節(jié)，包括機械負載和材料性質(zhì)等[34-35]。隨著生物模擬材料的發(fā)展，出現(xiàn)了更多有關(guān)ECM機械強度影響干細胞自我更新和行為的證據(jù)。通常用彈性模量表示ECM強度，不同彈性模量的材料指導干細胞分化成不同種類的細胞。Zouani等[36]對不同強度支架上BMP-2對干細胞調(diào)節(jié)的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs對不同強度水凝膠的應答存在差異，導致細胞分化方向不同。同時，生長因子的存在可調(diào)節(jié)機械信號對干細胞的作用。

目前認為，ECM與干細胞相互作用的媒介可能與整合蛋白有關(guān)。整合蛋白是由α和β亞基組成的異二聚體，每種亞基又分為多種類型。這些亞基對各種ECM蛋白的親和力和特異性存在差異，故在調(diào)節(jié)干細胞對微環(huán)境機械性質(zhì)的應答中也發(fā)揮不同的作用[27,37-39]。整合蛋白作為干細胞感知材料強度的開端，在機械信號轉(zhuǎn)導中尤為重要，既可將細胞外環(huán)境信號轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，又可將細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)運到細胞外，使得材料強度引發(fā)的多種信號之間的交叉作用影響基因表達并決定細胞命運[40]。因此，可以工程構(gòu)建生物材料并通過活化整合蛋白的途徑實現(xiàn)血管生成。Lin等[41]在特定培養(yǎng)基中對通過改變各組分濃度制備的不同強度和孔隙度的明膠-異丁烯酸水凝膠接種MSCs并誘導內(nèi)皮分化的研究發(fā)現(xiàn)，強度較低的凝膠(7.5%和10%)上MSCs內(nèi)皮細胞標志物信使RNA表達顯著高于強度較高的凝膠(15%)；組分濃度為10%的凝膠上MSCs成骨標志物信使RNA表達水平最高，可為MSCs形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)提供最佳條件，表明材料的機械性質(zhì)能影響MSCs的內(nèi)皮分化和成骨分化以及隨后的毛細血管樣結(jié)構(gòu)形成。

4 顯微裝配技術(shù)

支架材料的顯微結(jié)構(gòu)在血管形成中發(fā)揮重要作用，如更高孔隙度和更大孔徑允許體內(nèi)骨長入和血管形成，支架的平均孔徑與物質(zhì)轉(zhuǎn)運及細胞黏附相關(guān)。因此，構(gòu)建含有不同孔徑大小的微孔支架有利于骨形成和血管形成。天然組織基質(zhì)是由孔、纖維、脊、溝、凹等納米特征構(gòu)成的復雜結(jié)構(gòu)。研究證明，ECM的表面特征能顯著影響細胞的黏附、增殖、排列、遷移和分化，其中微米級表面特征可以控制細胞形狀和定位，納米級表面特征以纖維直徑、長度和交聯(lián)樣式及表面不規(guī)則性等方式為細胞提供幾何學刺激信號，從而調(diào)節(jié)細胞與基質(zhì)間的相互作用[42]。納米結(jié)構(gòu)催生納米技術(shù)成為組織工程和再生醫(yī)學的重要研究領(lǐng)域。應用顯微納米裝配技術(shù)可制備出更加精細復雜的支架材料，更好地模擬天然ECM的功能[43]。

4.1電噴技術(shù) 電噴技術(shù)是一種從聚合物溶液中獲得納米纖維的新技術(shù)。用于組織工程的優(yōu)勢主要有：①表面積與體積的比值高。②結(jié)構(gòu)、功能和形態(tài)類似膠原纖維，但無導致生物污染的風險?？扇藶檎{(diào)控獲得不同結(jié)構(gòu)和形狀的納米纖維，效仿天然ECM，為細胞長入和骨再生提供更有利的微環(huán)境。不足之處是在構(gòu)建結(jié)構(gòu)更復雜的支架方面仍欠缺靈活性。Lü等[44]在PLGA電噴支架表面用肝素固定VEGF，實現(xiàn)VEGF的持續(xù)釋放，且與血管內(nèi)皮細胞一起增強MSCs的血管生成。Jundzi等[45]利用電噴技術(shù)構(gòu)建管形合成聚合物支架的動物體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，植入腹膜后有更多更大的血管形成并遷移進入支架內(nèi)，無炎癥反應發(fā)生，支架與宿主組織整合更好。

4.2逐層裝配技術(shù)(layer-by-layer assembly，LBL) 為了滿足生物材料同時具有誘導血管生成和成骨作用的需要，研究者提出了構(gòu)建分層支架的概念[46]。分層支架使每層轉(zhuǎn)運不同信號，在不同區(qū)域分別遞呈不同生物活性因子，相較于簡單混合各種生物活性因子的方式，能更好地評估不同生化信號的作用。LBL是一種制備基于膜組分互補作用的多層膜的自我裝配技術(shù)。相較于其他表面設計技術(shù)，LBL以簡單、多用途及納米結(jié)構(gòu)調(diào)控的優(yōu)勢引起廣泛關(guān)注。Wang等[47]采用基于LBL技術(shù)的從頭合成策略，制備出一種仿生骨膜。骨修復和重建實驗顯示該仿生骨膜重現(xiàn)了骨膜骨修復的全過程，為進一步研制多組分和多功能人工骨膜提供了技術(shù)平臺。Gentile等[48]利用LBL裝配技術(shù)分別將增強細胞黏附和增殖、指導干細胞分化和提高礦物質(zhì)基質(zhì)形成的肽片段融合到支架材料中，誘導產(chǎn)生良好的體內(nèi)應答。

4.3模塊裝配技術(shù) 模塊裝配技術(shù)通過模擬復雜組織的顯微結(jié)構(gòu)特征，為制備更大和更多的復雜組織構(gòu)建物提供可行的途徑。一般先制備不同生物材料組分、細胞類型和(或)生物活性因子的亞單元，然后組裝成能模擬天然組織空間變化的多元工程復合體，其顯著優(yōu)點是能制備結(jié)構(gòu)更加復雜的生物材料。不同模塊發(fā)揮各自的功能，通過加入促血管生成亞單元可以改進工程構(gòu)建物的血管生成，常被用于提高組織工程構(gòu)建物的血管化，包括血管化骨[49-50]。目前該策略還只作為了解和檢查細胞應答的體外研究工具。臨床轉(zhuǎn)化中仍需大量體內(nèi)動物實驗研究確定如何保持提高信號可控性與裝配復雜程度之間的平衡，達到降低復雜裝配步驟導致較高治療成本的目的。

5 小 結(jié)

生物材料作為成骨細胞生長和血管系統(tǒng)建立的模板，其類型選擇和功能修飾是骨組織工程技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來，骨組織工程血管化研究方面已取得長足進步，但是由于骨組織工程的特殊性和復雜性，距離完全替代天然骨的目標仍任重道遠。隨著細胞生物學、材料學和生物醫(yī)學工程的發(fā)展，聯(lián)合多學科技術(shù)優(yōu)勢共同攻克骨組織工程血管化難題將是未來的發(fā)展趨勢。