楊燕平，常清賢

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510515)

產(chǎn)前多種不良因素可引起胎兒大腦神經(jīng)發(fā)育異常，從而增加子代神經(jīng)精神疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。子代神經(jīng)精神疾病潛伏期長，通常在發(fā)病的數(shù)年后診斷，缺乏客觀和敏感的早期診斷指標(biāo)[2]。因此，如何在臨床癥狀出現(xiàn)前早期診斷、干預(yù)和治療至關(guān)重要。外泌體是一種具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的納米級細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，直徑為40～120 nm。20世紀(jì)80年代，外泌體首先在網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，后被命名為“exosome”,隨后發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞均可分泌外泌體到細(xì)胞外環(huán)境。外泌體內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及RNAs等多種活性分子，介導(dǎo)體內(nèi)不同類型細(xì)胞間的通訊，從而影響機(jī)體生理和病理狀態(tài)[3]。作為一種新型的細(xì)胞間通訊方式，外泌體可靶向運(yùn)輸特異性蛋白質(zhì)及微RNAs(microRNAs,miRNAs)等遺傳物質(zhì)，參與胚胎神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)精神疾病如自閉癥、精神分裂癥等的病理生理過程[4-5]，發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、傳遞信息載體的作用，是近年來研究的熱點(diǎn)。外泌體廣泛存在于血液、母乳、尿液、羊水、腹水、腦脊液等生物體液中[6-7]。研究表明，胎兒神經(jīng)源性外泌體在妊娠早期約6周即可在母體外周血循環(huán)中檢測到，其是一種非侵入性的早期診斷和評估胎兒神經(jīng)發(fā)育及腦損傷的方法[2,8]，可能是潛在的生物標(biāo)志物，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，可為疾病的預(yù)防、早期診斷以及靶向治療提供新思路?，F(xiàn)就外泌體與胚胎神經(jīng)發(fā)育及子代神經(jīng)精神疾病的關(guān)系的研究進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體概述

1.1外泌體的形成和釋放 外泌體主要通過內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體途徑由細(xì)胞多泡體(multivesicular body,MVB)內(nèi)出芽形成[6]。外泌體胞膜由鞘磷脂、膽固醇、富含神經(jīng)酰胺的脂筏等組成，形態(tài)規(guī)則，大小相對一致，電鏡下呈杯狀半透明結(jié)構(gòu)[3]。MVB可分為分泌型和降解型兩種。在分泌型MVB中，4種蛋白復(fù)合體及輔助蛋白共同參與形成MVB，然后與細(xì)胞膜融合向細(xì)胞外環(huán)境釋放外泌體。在降解型MVB中，內(nèi)體囊泡與內(nèi)體腔膜融合，隨后與溶酶體融合降解形成外泌體。目前尚無能夠識別分泌型MVB和降解型MVB的蛋白標(biāo)志物。此外，可能還存在其他非依賴內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體的途徑，包括神經(jīng)酰胺、熱激蛋白等。外泌體的形成和釋放受多種因素的影響，如GTP酶、MVB錨定機(jī)制、Rab家族因子等[9-10]。

1.2外泌體的內(nèi)容物及特點(diǎn) 外泌體包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及miRNAs等多種活性內(nèi)容物,可以靶向傳遞活性內(nèi)容物給目標(biāo)細(xì)胞或器官，發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)等作用，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間遺傳物質(zhì)的交換[10]，但具體機(jī)制尚不明確。外泌體的雙層脂質(zhì)膜可以保護(hù)攜帶的活性內(nèi)容物在細(xì)胞釋放后避免體內(nèi)通路和RNA酶的降解，同時(shí)逃避免疫系統(tǒng)的影響，因此外泌體有良好的循環(huán)穩(wěn)定性，且易通過血腦屏障、血腦脊液屏障、胎盤屏障等生物屏障[11-14]。

1.3外泌體在神經(jīng)細(xì)胞通訊中的作用 外泌體在神經(jīng)細(xì)胞間的通訊中發(fā)揮著重要作用，如在神經(jīng)元與神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間傳遞信號，促進(jìn)神經(jīng)軸突再生，增加神經(jīng)元活性，維持神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的完整性；神經(jīng)元去極化后分泌的外泌體在突觸間選擇性修剪非活性突觸，調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸的可塑性[13]；促進(jìn)神經(jīng)元分化，缺氧和饑餓狀態(tài)下的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體具有神經(jīng)保護(hù)作用[5]。

2 外泌體與胚胎神經(jīng)發(fā)育

外泌體在神經(jīng)細(xì)胞間傳遞信息，與神經(jīng)發(fā)育及功能密切相關(guān)[4]。幾乎所有的神經(jīng)細(xì)胞都能釋放出miRNAs，其中大部分被包裹在EVs,包括外泌體中，并能在生物液體中檢測到[2,8,12]。妊娠6周時(shí)就可以在孕婦循環(huán)中檢測到胎盤源性外泌體，是非妊娠女性的50倍[15]。外泌體在母胎通訊交流過程中維持胎盤穩(wěn)態(tài)[16]，參與胎兒神經(jīng)發(fā)育[8]、妊娠相關(guān)疾病[15]及自閉癥等[13]的多種生理及病理過程。

2005年首次在小鼠胚胎腦發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)管腔外泌體的存在[17]，隨后發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的外泌體可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長和存活。Feliciano等[18]研究表明，人類胚胎神經(jīng)干細(xì)胞源性外泌體攜帶特異性miRNAs和蛋白質(zhì)，可激活胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)通路，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增。神經(jīng)源性外泌體在神經(jīng)細(xì)胞間傳遞信號，對神經(jīng)發(fā)育的影響主要取決于內(nèi)容物。腦組織中富含miRNAs，其在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)，對腦神經(jīng)發(fā)育和分化過程以及神經(jīng)細(xì)胞功能起關(guān)鍵作用[8,19]。

Moreau等[20]通過RNA測序技術(shù)對胎兒、產(chǎn)后早期以及成人的腦組織進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)了人類大腦發(fā)育過程中不同miRNAs的時(shí)間表達(dá)譜。研究顯示，miRNAs在胎兒、早期出生后以及成年腦組織中的表達(dá)特征顯著不同，大腦發(fā)育相關(guān)的特異性miRNAs如miR-124和miR-9在胚胎神經(jīng)發(fā)育早期表達(dá)上調(diào)，而部分miRNAs在出生后表達(dá)下調(diào)。與自閉癥、精神分裂癥以及抑郁癥等相關(guān)的基因組中，差異表達(dá)的miRNAs靶點(diǎn)高度富集[21]。進(jìn)一步研究顯示，孕婦妊娠期在不利的環(huán)境因素或緊張經(jīng)歷作用下可通過改變表觀遺傳調(diào)控機(jī)制如miRNAs的表達(dá)、DNA甲基化以及組蛋白修飾，影響胎兒的內(nèi)分泌機(jī)制和大腦發(fā)育過程，增加子代神經(jīng)和精神疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。除miRNAs外，外泌體也含有豐富的蛋白質(zhì)，如熱激蛋白、四次跨膜蛋白，參與細(xì)胞間通訊[7]。在整個(gè)發(fā)育過程中，基因表達(dá)受到一系列進(jìn)化保守蛋白如Notch、Wnt、轉(zhuǎn)化生長因子-β等的調(diào)控[6]。

3 外泌體在神經(jīng)精神疾病中的診斷作用

3.1自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD) ASD是目前最熱門的研究領(lǐng)域之一，是以持續(xù)的社會缺陷和有限重復(fù)的行為模式為核心癥狀的一組神經(jīng)發(fā)育障礙[4]。Goetzl等[8]研究顯示，可從孕婦血漿中分離提純出胎兒神經(jīng)源性外泌體，胎兒神經(jīng)源性外泌體的相對比例、絕對數(shù)量及神經(jīng)細(xì)胞類型隨妊娠期階段的改變而改變，而在非妊娠期孕婦的血漿中無法檢測到，提示胎兒神經(jīng)源性外泌體可作為妊娠早期無創(chuàng)評估不良因素宮內(nèi)暴露，造成胎兒神經(jīng)發(fā)育障礙的一種強(qiáng)有力的工具，最終降低子代ASD的發(fā)生率。ASD患者組織或血清中miRNAs的水平會發(fā)生改變[22]，而循環(huán)中的miRNAs非常穩(wěn)定，可作為一種非侵入性的診斷標(biāo)志物[23]。另一研究顯示，ASD患者血清中差異表達(dá)的miRNAs(如hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-328)預(yù)測靶基因富集于ASD相關(guān)的神經(jīng)通路，提示hsa-miR-181b-5p等miRNAs可能是ASD相關(guān)的潛在的早期診斷生物標(biāo)志物[4]。綜上，檢測孕婦循環(huán)中胎兒神經(jīng)源性外泌體或差異表達(dá)的特異性miRNAs可作為早期診斷宮內(nèi)胎兒神經(jīng)發(fā)育情況及評估ASD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的無創(chuàng)性方法之一。但目前缺乏關(guān)于miRNAs參與ASD的直接證據(jù)，尚需進(jìn)一步研究明確相關(guān)的特異性外泌體源性miRNAs[22]。

3.2精神分裂癥 精神分裂癥是一種嚴(yán)重的精神障礙，以妄想、幻覺等行為異常、運(yùn)動能力受損及認(rèn)知缺陷為特征，影響著全世界1%的人群，發(fā)病率和死亡率逐年升高[24]。一項(xiàng)薈萃分析顯示，產(chǎn)科并發(fā)癥如妊娠期糖尿病、先兆子癇等可增加胎兒出生后精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)[25]。在精神分裂癥患者中，特異性外泌體源性miRNAs(miR-497)差異表達(dá)顯著增加[24]。此外，循環(huán)中的miRNAs參與了精神分裂癥的病理過程，并可作為循環(huán)生物標(biāo)志物[26-27]。在一項(xiàng)涉及330例精神分裂癥患者和202例健康者的薈萃分析中，精神分裂癥患者外周血單核細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs(如miR-181b-5p等)診斷精神分裂癥的敏感性和特異性均較高，提示可作為診斷精神分裂癥的生物標(biāo)志物[27]。目前外泌體源性miRNAs與精神分裂癥之間的具體關(guān)系還不明確，即外泌體源性miRNAs的變化是精神分裂癥發(fā)病機(jī)制的一部分，還是一種適應(yīng)性代償改變，尚需行進(jìn)一步的大樣本研究證實(shí)。

3.3其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病 阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，是以記憶力減退和認(rèn)知能力下降為特點(diǎn)的復(fù)雜疾病。血液中神經(jīng)源性外泌體中Tau蛋白(如P-S396-tau)的水平變化可在臨床發(fā)病前早期預(yù)測AD的發(fā)生[28]。研究表明，體液中神經(jīng)外泌體源性miRNAs已成為解決AD患者早期診斷困難的有力工具[13,29]。此外，在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤方面，腫瘤相關(guān)的特異性miRNAs、長鏈非編碼RNAs等可作為新型生物標(biāo)志物，前景良好。外泌體可從癌癥患者的血清或腦脊液中分離出來，其中神經(jīng)腫瘤來源的外泌體 miRNAs 的表達(dá)水平與腫瘤的診斷具有顯著的相關(guān)性[30]。相比傳統(tǒng)的影像學(xué)或病理學(xué)方法，生物體液來源的神經(jīng)腫瘤外泌體及其攜帶的內(nèi)容物(特異性miRNAs等)是一種快速、低侵入性、可靠的生物標(biāo)志物。以上方法均起到液體活檢的作用，可減少或避免外科手術(shù)、腦組織活檢等侵入性檢查[30]。

4 外泌體在神經(jīng)精神疾病治療中的作用

4.1潛在的治療靶點(diǎn) AD的主要病理特征是病理性Tau蛋白的積累，在疾病早期Tau蛋白從內(nèi)嗅皮質(zhì)傳播到海馬區(qū)。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中主要的吞噬細(xì)胞，與病理性Tau蛋白的傳播累積過程具有相關(guān)性，但它們是如何參與Tau蛋白傳播的尚不清楚。Asai等[31]的研究顯示，在AD中小膠質(zhì)細(xì)胞通過外泌體分泌傳播Tau蛋白，并且抑制外泌體的合成可顯著減少蛋白Tau在體內(nèi)外的繁殖傳播，表明外泌體分泌途徑可能是治療AD的靶點(diǎn)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，人類脂肪細(xì)胞中的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可分泌含有功能性腦啡肽酶的外泌體，降解已分泌的和細(xì)胞內(nèi)的β淀粉樣蛋白[32]。研究發(fā)現(xiàn)，將載有針對AD治療靶點(diǎn)BACE1(編碼β分泌酶1)的內(nèi)源性小干擾RNAs的外泌體注入野生型小鼠中，可觀察到BACE1明顯下調(diào)，這表明外泌體可作為治療AD的一種新途徑[32]。改變大腦中特定的miRNAs的水平可改變行為[23]，如輸注含有小干擾RNA的外泌體可使亨廷頓患者35%的miRNAs沉默表達(dá)，從而使其行為表現(xiàn)改變。此外，基于外泌體的腫瘤免疫療法有望將外泌體作為“疫苗”用于預(yù)防傳染性疾病或胎兒疾病的宮內(nèi)治療[23]，但目前還缺乏臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

4.2新型藥物傳送載體 納米技術(shù)的發(fā)展為疾病的診治提供了新方法。與傳統(tǒng)合成的納米輸送系統(tǒng)相比，外泌體循環(huán)穩(wěn)定、免疫原性低、生物相容性和生物屏障通透性好[11]。來自成人干細(xì)胞的外泌體有望成為向大腦輸送治療藥物，從而治療腦部疾病的一種新策略。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞是一種可以從多種組織中分離出來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的具有自我更新能力的多能祖細(xì)胞，在不同因素作用下可產(chǎn)生大量具有不同特征的外泌體[33]。外泌體可在細(xì)胞間穿梭輸送RNAs，并在受體細(xì)胞中翻譯，產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)，提供重要信號，進(jìn)而調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的功能[10]。間充質(zhì)干細(xì)胞或生物工程組裝的外泌體可作為腫瘤藥物治療的載體[11]，可降低致瘤風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)揮抗癌或抑制化療耐藥的作用，可作為下一代新型藥物輸送系統(tǒng)的候選載體[34]。作為新型的基因傳遞載體，外泌體為疾病的基因治療提供了新途徑[35]。外泌體有獨(dú)特的優(yōu)勢，既可通過多種生物屏障，又能發(fā)揮多種細(xì)胞間遺傳通信，可發(fā)生在微環(huán)境中，也可發(fā)生在遠(yuǎn)處，即外泌體以類似激素的方式在體循環(huán)中輸送通訊信號進(jìn)而影響受體細(xì)胞的功能。外泌體能夠遠(yuǎn)距離將核酸傳遞給細(xì)胞的能力也使其成為基因治療的理想載體，有望成為用于靶向治療胎兒發(fā)育異常及相關(guān)疾病的一種新型的內(nèi)源性天然藥物載體，從而減少藥物對母體造成的不良影響。目前也存在一些問題，如缺乏統(tǒng)一的外泌體分離和量化方法、潛在的不良反應(yīng)，未來需進(jìn)一步大樣本臨床研究去驗(yàn)證[34]。

4.3監(jiān)控病情狀態(tài)或進(jìn)展 生物體液中的外泌體攜帶著特異性活性物質(zhì)，可作為監(jiān)測神經(jīng)疾病狀態(tài)的一種有效手段。研究表明，AD患者外泌體中的磷酸化Tau和β淀粉樣蛋白1-42水平的升高可幫助監(jiān)測AD患者的疾病狀態(tài)[28]。另一項(xiàng)研究通過分析ASD與健康者尿液中的微生物群及其外泌體發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，ASD組中微生物群的分布發(fā)生了顯著變化，提示ASD患者尿液中細(xì)菌來源的外泌體可作為快速評估ASD患者微生物群改變以及監(jiān)測ASD患者行為的有效工具[36]。胎兒DNA可穿過胎盤在妊娠早期母體的循環(huán)血中被提取分離出來，從母體血漿中分離純化的特異性的胎兒神經(jīng)源性外泌體可作為妊娠早期監(jiān)測胎兒神經(jīng)發(fā)育的一種有效指標(biāo)。此外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤相關(guān)特異性外泌體可用于監(jiān)測癌癥進(jìn)展或新出現(xiàn)的耐藥細(xì)胞，為疾病的精準(zhǔn)預(yù)測、治療和干預(yù)提供新途徑[31]。但目前外泌體尚處于初步研究階段，有待進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。

4.4再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用 目前干細(xì)胞治療已經(jīng)成為改善心肌梗死后心臟重塑的一種潛在方法。胎兒和圍生期心臟干細(xì)胞或小兒心臟祖細(xì)胞來源的外泌體具有取材容易、自我更新強(qiáng)以及無瘤性的特性，具有促進(jìn)心肌再生、修復(fù)以及改善心臟功能的作用[37-38]。CD34+細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等多種類型細(xì)胞來源的外泌體可通過旁分泌或其他潛在機(jī)制減少血管纖維化、促進(jìn)血管修復(fù)，進(jìn)而改善心肌功能。目前關(guān)于胎兒神經(jīng)系統(tǒng)再生的研究相對較少，且主要基于體外實(shí)驗(yàn)。胚胎、臍帶等多種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體具備多向分化、免疫排斥小、致瘤風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)點(diǎn)，可用于神經(jīng)組織的再生修復(fù)[39]。對腦卒中動物模型的研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可誘導(dǎo)神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)血管重塑，促進(jìn)神經(jīng)再生，為干細(xì)胞治療疾病提供新思路[40]。

5 小 結(jié)

外泌體作為一種新的細(xì)胞間通訊方式和載體，在胚胎神經(jīng)發(fā)育和子代神經(jīng)精神疾病的診治中發(fā)揮著重要作用。目前大部分研究基于體外試驗(yàn)，且部分研究結(jié)果不一致，因而需要大樣本的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證[11,34-35]。外泌體具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展及研究的深入將為解決臨床問題提供新的思路和依據(jù)。未來的研究方向可能包括：①利用生物信息分析學(xué)或下一代基因測序技術(shù)等從分子或基因水平探討外泌體與母胎疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系；②探索外泌體相關(guān)的母胎疾病治療新靶點(diǎn)及新型藥物載體以研發(fā)新藥物；③尋找特異性的外泌體生物標(biāo)志物用于疾病的早期診斷或病情監(jiān)測；④基于外泌體的再生醫(yī)學(xué)或?qū)m內(nèi)基因治療，治療胎兒或嬰兒某些先天神經(jīng)發(fā)育缺陷或畸形，進(jìn)行精準(zhǔn)治療和個(gè)性化治療。