董年 宋晨劍 董莉 陳成水

彌漫性肺泡損傷是肺損傷氣血屏障破壞的重要病理特征，失控的炎癥瀑布反應(yīng)是肺泡損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-2]。異常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)了失控的炎癥瀑布反應(yīng)，包括調(diào)節(jié)基團的表達(dá)突變和蛋白激酶的持續(xù)活化，其中異常磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)了肺損傷炎癥瀑布反應(yīng)中的核心信號流[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cells，AECs）在肺損傷炎癥瀑布反應(yīng)中扮演啟動細(xì)胞和繼發(fā)受體的角色[5]，探究肺損傷時AECs中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常改變可以深入揭示肺損傷的發(fā)病機制。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是肺損傷時重要的炎癥介質(zhì)，結(jié)合之前研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以活化AECs中的PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與肺損傷炎癥的起始和轉(zhuǎn)歸[6]，本文擬探討TGF-β1是否可以調(diào)控PI3K亞基的構(gòu)成變化，以進(jìn)一步認(rèn)識TGF-β1調(diào)控PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)和底物特性PI3K家族包括ClassⅠ、Ⅱ和Ⅲ3類，具體包括Ⅰ型催化亞基（PIK3CA、PIK－3CB、PIK3CD 和 PIK3CG）、Ⅰ型調(diào)節(jié)亞基（PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5 和 PIK3R6）、Ⅱ型 PI3K 亞基（PIK3C2A、PIK3C2B和 PIK3C2G）和Ⅲ型 PI3K亞基（PIK3R4和PIK3C3）[7]。因此，明確PI3K家族在AECs中的表達(dá)情況和探究TGF-β1調(diào)控PI3K亞基的構(gòu)成變化，有助于尋找潛在的肺損傷預(yù)測分子標(biāo)志物和診治分子靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗細(xì)胞 人AECs A549細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基（規(guī)格：500ml，批號：8118021）、FBS（規(guī)格：500ml，批號：1739464）購自美國 Gibco 公司；人重組 TGF-β1（規(guī)格：5μg，批號：0212209）購自美國PeproTech公司；兔抗人PIK3CD單抗（規(guī)格：100μl，批號：34050S）購自美國 CST 公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（規(guī)格：2 500次，批號：RD231236）、預(yù)染蛋白 Marker（規(guī)格：250μl，批號：00557320）、ECL 發(fā)光液（規(guī)格：100ml，批號：QH220370A）購自美國 Thermo公司；Trizol（規(guī)格：100ml，批號：162912）購自美國Invitrogen公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（規(guī)格：200次，批號：AK2601）購自日本TAKARA公司；其他生化試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。實時定量PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成，見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞株使用包含10%FBS和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 AECs中PI3K亞基mRNA表達(dá)水平檢測 獲取生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞鋪板，選取5ng/ml TGF-β1刺激 A549細(xì)胞，根據(jù)不同刺激時間（0、3、6、12、24和 48h）分組，收集各組細(xì)胞，按照Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA，分光光度計法測定總RNA水平。取總RNA 2μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以適量cDNA為模板進(jìn)行實時定量PCR法。實時定量PCR反應(yīng)條件為 95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 30s，共 40個循環(huán)。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，對目的基因進(jìn)行相對定量。

1.3.3 PIK3CD蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定總蛋白水平。每組取30μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉 2h，抗 PIK3CD 抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜10min 3次，抗兔抗體（1∶5 000）室溫孵育1.5h，再用TBST緩沖液洗膜10min 3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果以各蛋白與β-actin灰度值比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AECs中PI3K亞基mRNA表達(dá)水平 AECs中Ⅰ型PI3K催化亞基以表達(dá)PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD為主，見圖1。Ⅰ型PI3K調(diào)節(jié)亞基以表達(dá)PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3為主，見圖2。Ⅱ型PI3K亞基和Ⅲ型PI3K亞基以表達(dá)PIK3R4、PIK3C3、PIK3C2A和PIK3C2B為主，見圖3。

2.2 TGF-β1誘導(dǎo)PI3K亞基mRNA表達(dá)水平的變化TGF-β1可以誘導(dǎo)PIK3CD亞基mRNA的表達(dá)水平呈時間依賴性升高，與0h比較，12、24和48h的PIK3CD mRNA表達(dá)水平均升高，差異均有有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其余PI3K亞基mRNA表達(dá)水平均無明顯變化，見表2。根據(jù)PI3K亞基表達(dá)水平分析其在PI3K家族中的構(gòu)成比，發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)的PIK3CD在Ⅰ型PI3K催化亞基的構(gòu)成比呈時間依賴性升高，且在48h構(gòu)成比最高。

圖1 Ⅰ型PI3K催化亞基在AECs中的表達(dá)（PI3CG mRNA絕對表達(dá)量較低，圖中未顯示）

圖2 Ⅰ型PI3K調(diào)節(jié)亞基在AECs中的表達(dá)（PIK3R5和PIK3R6 mRNA絕對表達(dá)量較低，圖中未顯示）

圖3 Ⅱ型PI3K亞基和Ⅲ型PI3K亞基在AECs中的表達(dá)（PI3C2G mRNA絕對表達(dá)量較低，圖中未顯示）

表2 TGF-β1誘導(dǎo)PI3K亞基mRNA動態(tài)變化

2.3 TGF-β1誘導(dǎo) PIK3CD蛋白表達(dá)水平的變化TGF-β1可以誘導(dǎo)PIK3CD蛋白表達(dá)呈時間依賴性升高，48h 最高，見圖 4。

3 討論

PI3K是一類機體內(nèi)廣泛存在的特異性磷酸化磷脂酰肌醇激酶，其介導(dǎo)的PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與免疫炎癥、損傷修復(fù)和惡性轉(zhuǎn)化病理生理過程密切相關(guān)[8]。PI3K家族中14種PI3K亞基任一的基因位點突變或蛋白異常表達(dá)皆可以導(dǎo)致異?；罨腜I3K/Akt參與不同疾病的發(fā)生、發(fā)展。既往關(guān)于PI3K在肺部疾病中的研究多集中在腫瘤方面，突變的PIK3CA是肺癌驅(qū)動基因之一[9]，PIK3CA的突變導(dǎo)致PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的持續(xù)活化參與調(diào)控腫瘤的無限增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。近年來研究發(fā)現(xiàn)在肺損傷修復(fù)中同樣存在持續(xù)活化的PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中肺泡上皮中持續(xù)活化的PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與炎性介質(zhì)分泌、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換和胞外基質(zhì)分泌等密切相關(guān)[10-11]?？紤]到PI3K亞基在肺損傷炎癥起始轉(zhuǎn)歸中的重要角色，因此本文擬探討AECs中PI3K亞基的表達(dá)情況和TGF-β1是否可以調(diào)控PI3K亞基的構(gòu)成變化，期望以PI3K作為突破點為肺損傷發(fā)生、發(fā)展揭示新分子機制。

圖4 TGF-β1對PIK3CD蛋白表達(dá)的影響（a：TGF-β1誘導(dǎo)PIK3CD蛋白表達(dá)的電泳圖；b：TGF-β1誘導(dǎo)PIK3CD蛋白表達(dá)水平升高；與 0h 比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

針對AECs中PI3K亞基mRNA表達(dá)檢測，本研究發(fā)現(xiàn)AECs中Ⅰ型PI3K催化亞基以表達(dá)PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD為主，Ⅰ型PI3K調(diào)節(jié)亞基以表達(dá)PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3為主，Ⅱ型PI3K亞基和Ⅲ型PI3K亞基以表達(dá)PIK3R4、PIK3C3、PIK3C2A和PIK3C2B為主。PI3K亞基包括催化和調(diào)節(jié)兩個功能，協(xié)同發(fā)揮作用，參與PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化。已知TGF-β1是參與肺損傷修復(fù)重要的炎癥介質(zhì)，AECs的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換、胞外基質(zhì)分泌與TGF-β1活化的PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)[12-13]，本研究深入探討了TGF-β1是否可以調(diào)控PI3K亞基的構(gòu)成變化。針對TGF-β1是否調(diào)控AECs中PI3K亞基構(gòu)成變化，本研究發(fā)現(xiàn) TGF-β1可以調(diào)控 AECs中PIK3CD催化亞基的表達(dá)，呈時間依賴性擴大PIK3CD在ClassⅠ型調(diào)節(jié)亞基中的比例。生理情況下PIK3CD在淋巴細(xì)胞中表達(dá)較為豐富，PIK3CD的突變或異常表達(dá)與B淋巴細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)[14]。Ge等[15]報道相較于正常對照，慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者氣道平滑肌細(xì)胞（ASMs）存在PIK3CD的過高表達(dá)，過高表達(dá)PIK3CD與ASMs收縮蛋白的合成和炎癥機制的釋放相關(guān)。與此同時Mercado等[16]報道COPD患者血液單個核細(xì)胞中過高表達(dá)的PIK3CD與其糖皮質(zhì)激素治療的不敏感性密切相關(guān)。目前PIK3CD在肺部疾病發(fā)病中的作用處于起始階段，PIK3CD經(jīng)調(diào)控氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和2型組蛋白去乙?；傅韧緩絽⑴c免疫調(diào)節(jié)、氣道炎癥和激素耐受等[11，17]，與肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以誘導(dǎo)AECs中PIK3CD的表達(dá)，然而過高表達(dá)PIK3CD與TGF-β1活化PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程之間的聯(lián)系亟待闡明?？紤]到催化亞基是PI3K的效應(yīng)器，其表達(dá)水平與PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的持續(xù)活化密切相關(guān)[18]，肺泡上皮中過高表達(dá)的PIK3CD可能是一個潛在的肺損傷和纖維修復(fù)的藥物干預(yù)靶點。

本研究在體外實驗中探討了TGF-β1調(diào)控AECs中PI3K亞基的構(gòu)成變化，但存在些許不足：首先，選取的AECs是永生化的腫瘤細(xì)胞，雖然細(xì)胞模型具備認(rèn)可度，但在原代細(xì)胞上驗證結(jié)果可能更為可信；其次，尚未在體內(nèi)實驗中證實肺損傷修復(fù)中AECs PI3K亞基的構(gòu)成變化，從而可以驗證體外實驗的結(jié)果。總之，本研究初步揭示TGF-β1調(diào)控AECs中PI3K亞基的構(gòu)成變化，提示PIK3CD可能是未來肺損傷防治的潛在靶點，為今后PIK3CD在肺損傷中的作用研究打下了一定的基礎(chǔ)。