許成，劉朝奇，黃艷芳，白敦耀，羅潔麗

(1.武漢科技大學(xué)附屬武漢市普仁醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430081；2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，宜昌 443002 )

免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint blockade，ICB)旨在通過抑制腫瘤微環(huán)境中免疫檢查點(diǎn)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，重新激活T細(xì)胞，恢復(fù)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而達(dá)到識別和清除腫瘤的目的[1-2]。其獨(dú)特的臨床療效，使得癌癥治療的適應(yīng)證不斷擴(kuò)大，為腫瘤免疫治療開啟了新篇章。近年來，以細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4) 和程序性死亡因子(programmed cell death protein-1，PD-1)及其配體(PD-ligand 1，PD-L1)為靶點(diǎn)的ICB在晚期癌癥患者中的臨床療效獲得肯定，美國食品藥品管理局(FDA)先后批準(zhǔn)了6種相關(guān)單克隆抗體，包括CTLA-4抑制劑ipilimumab(Yervoy)；PD-1抑制劑nivolumab(Opdivo)和pembrolizumab(Keytruda)；PD-L1抑制劑atezolizumab(Tecentriq)、durvalumab(Imfinzi)和avelumab(Bavencio)，分別用于晚期黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、膀胱上皮癌等惡性腫瘤的臨床治療。還有以LAG-3、TIM-3、VISTA等免疫檢查點(diǎn)為靶點(diǎn)的抑制劑在研究中[3]。目前，這種免疫治療尚不精準(zhǔn)，只有少數(shù)癌癥患者能夠獲得良好的療效[4]?；驒z測技術(shù)的飛速發(fā)展以及腫瘤基因組學(xué)認(rèn)識的不斷深入，將使得基因組學(xué)驅(qū)動的精準(zhǔn)腫瘤免疫治療成為可能。通過對腫瘤進(jìn)行基因檢測，為患者選擇合適的給藥方案提供遺傳學(xué)依據(jù)，能夠使免疫治療更加精準(zhǔn)有效。筆者將以臨床療效確切的CTLA-4、PD-1/PD-L1抑制劑為例，探討基因檢測對腫瘤ICB治療的重要意義以及其應(yīng)用。

1 基因檢測對ICB治療的意義

基于免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中PD-L1蛋白的表達(dá)，是最早被應(yīng)用于篩選合適患者的方法。迄今為止的臨床數(shù)據(jù)顯示，PD-L1的表達(dá)與癌癥患者對于ICB的高應(yīng)答率和無進(jìn)展生存率有關(guān)，但PD-L1表達(dá)陰性的患者也可能獲得很好療效[5]。CARBOGNIN等[6]基于Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗(yàn)中nivolumab、pembrolizumab或atezolizumab對癌癥患者的治療結(jié)果，系統(tǒng)地分析了腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)與患者療效的相關(guān)性，結(jié)果顯示PD-L1表達(dá)陽性的腫瘤對抑制劑有更高的應(yīng)答率，但仍有19.9%(154/773例)PD-L1表達(dá)陰性癌癥患者表現(xiàn)出客觀的反應(yīng)。因此需要腫瘤微環(huán)境免疫調(diào)節(jié)的更多信息指導(dǎo)合理用藥。

腫瘤細(xì)胞是由體細(xì)胞突變積累產(chǎn)生的，包括堿基替換、堿基插入和缺失、DNA斷裂和異常重組引起的重排以及DNA片段拷貝數(shù)的變化等[7]。在過去的十年中，基因檢測技術(shù)，尤其是下一代基因測序(next-generation sequencing，NGS)的革命性進(jìn)步，以及分析工具的智能化，使得研究人員能夠更準(zhǔn)確地描述癌癥的分類，預(yù)測癌癥患者的預(yù)后，選擇有效的癌癥治療方法和個(gè)性化的癌癥治療，尤其是癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)計(jì)劃的完成及“泛癌癥圖譜(pan-cancer atlas)”計(jì)劃的推進(jìn)，使NGS在腫瘤診斷和治療方面的應(yīng)用更為重要。NGS包括全基因組測序、全轉(zhuǎn)錄組測序、全外顯子測序和靶向測序等。NGS技術(shù)克服了Sanger測序局限性，它允許在一次試驗(yàn)中對整個(gè)基因組進(jìn)行系統(tǒng)分析，有助于識別腫瘤的分子特征，以及獲取腫瘤細(xì)胞的全基因組數(shù)據(jù)[8]。對這些數(shù)據(jù)的挖掘和分析將為臨床醫(yī)生提供有用的診斷和預(yù)后信息，成為腫瘤精準(zhǔn)治療的有力手段。

2 基因檢測與ICB的治療

2.1免疫檢查點(diǎn)基因檢測 T細(xì)胞活化受CTLA-4、PD-1/PD-L1等負(fù)性信號通路調(diào)節(jié)，CTLA-4、PD-1、PD-L1基因的單核苷酸多態(tài)性與自身免疫性疾病以及癌癥的治療和預(yù)后密切相關(guān)[9-11]。藥物基因組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)藥物的療效與藥物靶點(diǎn)基因多態(tài)性的關(guān)系密切[12]。因此ICB的作用靶點(diǎn)CTLA-4、PD-1、PD-L1的基因多態(tài)性可能是ICB療效差異的遺傳因素。在黑色素瘤患者中，BREUNIS等[13]已經(jīng)評估了7個(gè)CTLA-4單核苷酸多態(tài)性(rs 733618，rs 4553808，rs 11571317，rs 5742909，rs 231775，rs 3087243和rs 7565213)與ipilimumab反應(yīng)，與臨床反應(yīng)顯著相關(guān)的基因型為CTLA-4 rs4553808的G等位基因、rs11571327的T等位基因、rs231775的A等位基因位。在50例接受了nivolumab治療晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，NOMIZO等[14]檢測了患者血漿中PD-L1基因單核苷酸多態(tài)性，分析發(fā)現(xiàn)PD-L1 rs4143815為C/C或C/G基因型的患者和rs2282055為G/G或G/T基因型的患者有較高的無進(jìn)展生存率，而PD-L1 rs4143815為G/G基因型的患者和rs2282055為T/T基因型的患者均無治療效果，提示PD-L1 rs2282055和rs4143815的基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌患者的療效差異相關(guān)。因此通過單核苷酸多態(tài)性分析可以預(yù)測腫瘤患者對ICB治療的反應(yīng)性，指導(dǎo)臨床醫(yī)生的藥物選擇和治療方案設(shè)計(jì)。

2.2腫瘤細(xì)胞的微衛(wèi)星分析 微衛(wèi)星是自身DNA中的一段簡單重復(fù)的核苷酸序列。DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)功能異常造成微衛(wèi)星序列發(fā)生的錯(cuò)誤，稱為“微衛(wèi)星不穩(wěn)定性”(microsatellite instability，MSI)。MSI狀態(tài)可通過PCR或NGS技術(shù)檢測。腫瘤中DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷(mismatch repair deficiency，dMMR)導(dǎo)致高頻率微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability-high，MSI-H)表型。MSI-H會引起腫瘤細(xì)胞突變的積累，導(dǎo)致腫瘤的高突變負(fù)荷、新的腫瘤抗原表達(dá)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞增加以及上調(diào)免疫檢查點(diǎn)蛋白表達(dá)水平，從而影響ICB治療效應(yīng)[15-16]。近期的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，具有MSI-H表型的腫瘤使用PD-1抑制劑治療的有效率高于其他類型的腫瘤。LE等[16]在一項(xiàng)評估PD-1抑制劑pembrolizumab療效的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，將41例患者分為3組：11例dMMR結(jié)直腸癌，21例DNA錯(cuò)配修復(fù)正常的結(jié)直腸癌，9例非結(jié)直腸癌的dMMR癌癥患者包括膽管癌、胃癌等，結(jié)果顯示dMMR結(jié)直腸癌患者和非結(jié)直腸癌患者客觀反應(yīng)率分別為40%和71%，而DNA錯(cuò)配修復(fù)正常腫瘤患者沒有出現(xiàn)反應(yīng)，說明dMMR/MSI-H與pembrolizumab效果之間存在直接的相關(guān)性。nivolumab的Ⅱ期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示nivolumab對dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者有持久的療效和疾病控制，在74例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，23例(31.1%)取得研究人員評估的客觀反應(yīng)，51例(69%)患者在12周或更長時(shí)間里出現(xiàn)疾病控制[17]?；谇捌诘呐R床研究結(jié)果，F(xiàn)DA在2017年5月加速批準(zhǔn)了PD-1抑制劑pembrolizumab(Keytruda)用于治療表型為MSI-H或dMMR的實(shí)體腫瘤；2017年7月加速批準(zhǔn)了PD-1抑制劑nivolumab(Opdivo)用于治療具有MSI-H或dMMR表型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者[18-19]。因此通過微衛(wèi)星分析篩選的MSI-H表型腫瘤更能獲益于ICB的治療。

2.3腫瘤突變負(fù)荷檢測 腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden，TMB)即腫瘤基因組中每兆堿基中突變的數(shù)目。使用全外顯子測序技術(shù)(whole exome sequencing，WES)能夠檢測腫瘤樣本中所有的體細(xì)胞突變[9]。高TMB的腫瘤具有產(chǎn)生更多腫瘤新抗原的潛力，從而激活免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別和清除，提示高TMB能增強(qiáng)腫瘤對ICB治療的敏感性[20]。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ICB對于黑色細(xì)胞瘤和非小細(xì)胞肺癌等帶來了顯著療效，而對于胰腺癌、前列腺癌療效甚微。進(jìn)一步分析這些癌癥的突變負(fù)荷，發(fā)現(xiàn)對ICB治療有較高應(yīng)答率的腫瘤具有高突變負(fù)荷，包括黑色素細(xì)胞瘤和非小細(xì)胞肺癌；相反，胰腺癌和前列腺癌等具有較低的突變負(fù)荷，提示TMB與ICB治療的應(yīng)答率相關(guān)[21-22]。SNYDER等[23]應(yīng)用WES技術(shù)分析了64例接受CTLA-4抗體治療患者的惡性黑色素瘤外顯子基因，提示高突變負(fù)荷與持續(xù)的臨床反應(yīng)相關(guān)。RIZVI等[24]使用WES技術(shù)對患者進(jìn)行了非小細(xì)胞肺癌的外顯子序列分析，同樣發(fā)現(xiàn)具有較高突變負(fù)荷的非小細(xì)胞肺癌患者接受PD-1抗體的治療有較高的客觀反應(yīng)率和無進(jìn)展生成率。另外，吸煙肺癌患者的突變負(fù)荷遠(yuǎn)高于不吸煙肺癌患者[25]。因此，在PD-1抗體治療非小細(xì)胞肺癌患者中，觀察到吸煙患者的應(yīng)答率更高[5]。2017年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了基于NGS的癌癥體外診斷產(chǎn)品Foundation One CDx(F1CDx)，用于對腫瘤324個(gè)基因的遺傳變異以及基因組MSI、TMB的檢測分析，進(jìn)一步肯定了MSI、TMB的應(yīng)用價(jià)值。因此TMB對于ICB療效具有潛在的預(yù)測意義。

2.4腫瘤特異性抗原檢測 腫瘤特異性抗原(tumor specific antigens，TSAs)是由癌細(xì)胞的基因突變產(chǎn)生的，在正常細(xì)胞中不表達(dá)。由于這類抗原對腫瘤細(xì)胞具有高度的特異性，可使免疫細(xì)胞能夠區(qū)分癌變細(xì)胞和正常細(xì)胞，從而避免自身免疫風(fēng)險(xiǎn)，是腫瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)，近年來引起了廣泛的關(guān)注。有研究表明，TSA是ICB發(fā)揮治療效應(yīng)的關(guān)鍵因素之一。VAN ALLEN等[26]對110例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者進(jìn)行了全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)有大量新抗原的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤腫瘤患者更有可能對CTLA-4抑制劑治療產(chǎn)生應(yīng)答。GUBIN等[27]在小鼠MCA肉瘤模型中展示了接受PD-1或/和CTLA-4抑制劑治療的小鼠能介導(dǎo)TSA激活T細(xì)胞并導(dǎo)致腫瘤排斥反應(yīng)?，F(xiàn)在NGS技術(shù)能以前所未有的精確度和速度揭示單個(gè)腫瘤(突變體)的突變譜，但從非同義突變中篩選出腫瘤特異性突變依賴于專業(yè)的分析技術(shù)，因此，檢測腫瘤特異性抗原在臨床上的應(yīng)用仍受到限制。

2.5人類白細(xì)胞抗原檢測 腫瘤抗原通過加工被呈遞到細(xì)胞表面才能被T細(xì)胞識別，這是ICB治療的前提基礎(chǔ)。腫瘤抗原需要與人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)相結(jié)合后才能提呈到細(xì)胞表面[1]，因此HLA在某些腫瘤表達(dá)下調(diào)或丟失，直接影響ICB的療效。INOUE等[28]對比了13例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者接受nivolumab治療前后的免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在治療前，應(yīng)答者的HLA-Ⅰ類的HLA-A基因mRNA表達(dá)水平顯著高于非應(yīng)答者，說明HLA-A基因的高表達(dá)水平與nivolumab較好的臨床療效相關(guān)。CHOWELL等[29]通過對1500多例接受過ICB治療的癌癥患者的HLA-Ⅰ類基因型分析，發(fā)現(xiàn)HLA-Ⅰ基因雜合性越高的癌癥患者越有可能從ICB的治療中獲益。此外，有研究表明HLA-Ⅰ類抗原表達(dá)與ICB的耐藥性有密切關(guān)系。ZARETSKY等[30]應(yīng)用全外顯子測序分析了4例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的活檢標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)對PD-1抗體的獲得性耐藥可通過JAK 1/2突變失活下調(diào)IFNγ信號通路；或通過B2M基因突變介導(dǎo)HLA-Ⅰ類抗原表達(dá)的缺失。GETTINGER[31]等在對ICB耐藥的肺癌患者以及B2M基因敲除的肺癌小鼠模型中觀察到B2M的獲得性純合子丟失，使得HLA-Ⅰ類表達(dá)缺乏，導(dǎo)致對ICB抵抗。因此應(yīng)用基因檢測技術(shù)分析HLA的表達(dá)情況，可用于指導(dǎo)ICB治療。

3 結(jié)束語

基因檢測技術(shù)的發(fā)展以及其在臨床應(yīng)用的拓展為ICB的精準(zhǔn)治療帶來新的思路。針對每個(gè)腫瘤基因組進(jìn)行的基因檢測分析，掌握影響ICB療效的相關(guān)基因信息，可為每個(gè)患者提供個(gè)性化的用藥策略。一些ICB治療的相關(guān)基因變化，包括免疫檢查點(diǎn)基因多態(tài)性、微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)、腫瘤突變負(fù)荷等在臨床試驗(yàn)中已被證明對ICB臨床療效有一定的預(yù)測價(jià)值，但這些標(biāo)志物的適用范圍、協(xié)同關(guān)系和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)還有待進(jìn)一步明確。NGS已在大規(guī)模的腫瘤基因檢測中展現(xiàn)了巨大應(yīng)用前景，在臨床試驗(yàn)中通過對晚期癌癥患者進(jìn)行基因組檢測，為患者提供合理的治療方案，但目前NGS的臨床推廣應(yīng)用還存在若干問題，如成本效益、周轉(zhuǎn)時(shí)間和臨床結(jié)果解釋等。相信在未來的腫瘤治療中，隨著基因檢測技術(shù)在臨床應(yīng)用中的進(jìn)一步推廣，尤其是“泛癌癥圖譜”的研究進(jìn)展，及其對各類腫瘤相關(guān)基因的挖掘，使得基于基因檢測實(shí)時(shí)監(jiān)控抗腫瘤免疫的應(yīng)用成為可能，將能更好指導(dǎo)ICB藥物的個(gè)體化精準(zhǔn)治療。