劉玨玲,安琪,陳素娥,趙龍山,劉亮亮

(1.山西衛(wèi)生健康職業(yè)學院山西生物樣品分析檢測中心,山西 晉中 030619;2.山西省中醫(yī)學校,山西 晉中 030619;3.沈陽藥科大學藥學院,遼寧 沈陽 110013)

中藥的活性物質(zhì)和作用機理的研究，是中藥發(fā)展的瓶頸問題。中藥及復方具有多組分、多靶點的特點[1]，從而具有復雜性、多效性和某些成分的雙向調(diào)節(jié)性。如果單純依靠傳統(tǒng)分離分析技術(shù)研究中藥及復方中的藥效物質(zhì)，過程復雜且難度較大，限制了中醫(yī)藥的發(fā)展進程[2]。分子生物色譜(molecular biochromatography,MBC)是一種以生物大分子為固定相配基的新型液相色譜技術(shù)，其原理是分子特異性識別，具有重現(xiàn)性好、分析速度快、具有藥理學意義等特點。由于不同藥物組分與生物大分子結(jié)合度及親和性不同，使得其在色譜柱上的保留時間不同，由此可將活性物質(zhì)快速篩選出來。同時MBC與其他分析檢測技術(shù)結(jié)合，能進一步闡明與機體有關(guān)的藥效組分，將其應(yīng)用于中藥復方活性成分的篩選，可有效地排除無生物活性成分的干擾，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供新的解決途徑[3-6]。本文對近10年國內(nèi)外分子生物色譜技術(shù)在中藥物質(zhì)基礎(chǔ)分析方面的應(yīng)用和研究進展進行了歸納總結(jié),旨在為藥學工作者更好地掌握和應(yīng)用分子生物色譜技術(shù)提供參考。

1 MBC常用大分子

1.1 血漿蛋白 血漿蛋白能與藥物發(fā)生可逆結(jié)合成為“血漿蛋白-藥物復合物”，到達作用部位發(fā)生藥理作用。將血漿蛋白固載于載體上作為生物色譜填料，形成一種可以模擬體內(nèi)環(huán)境中藥物與血漿蛋白間相互作用的色譜系統(tǒng)，由于不同的藥物分子與血漿蛋白的結(jié)合率具有差異，它在固定相的保留行為也不同，結(jié)合色譜技術(shù)中的各種參數(shù)計算，一方面可以篩選中藥中的活性物質(zhì)，還能進行藥物與血漿蛋白的作用關(guān)系的研究[7-8]。

1.1.1 人血白蛋白(human serum albumin，HSA) HSA是人類血液中最豐富的血漿蛋白質(zhì)，其分子量為66.5 kDa，血清中濃度約為35～50 g·L-1。HSA能與帶負電荷的化合物如激素、脂肪酸等結(jié)合并運輸[9]。孔亮等[10]把HSA固定在硅膠上作為HPLC中的固定相，選擇50 mmol·mL-1含乙腈的磷酸鉀緩沖液為流動相，分離了當歸、赤芍、黃芪、川芎的水提液，建立了4種中藥的生物色譜圖庫，之后優(yōu)化當歸水提液的MBC條件，進一步研究當歸水提液中阿魏酸與藁本內(nèi)酯的含量，分別是0.028%和0.01%，從而對當歸指標成分進行質(zhì)量控制。牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)與HSA結(jié)構(gòu)具有相似性且價格低廉，因此可以替代HSA制備BSA色譜柱用于中藥活性物質(zhì)篩選[11]。潘再法等[12]利用靜電吸附原理制備出BSA整體柱應(yīng)用于當歸甲醇液的成分分析，將所得的2個餾分進行氣相色譜-質(zhì)譜分析，鑒定出其含量最多的成分為藁本內(nèi)酯。

1.1.2 酸性糖蛋白(α1- acid glycoprotein，AGP) AGP是由183個氨基酸組成的多肽鏈，平均分子量為41 kDa，濃度在0.5～1.0 mg·mL-1之間，且隨著病理變化而改變[13]。AGP是許多中性藥物如普萘洛爾、阿咪普拉明、利多卡因和維拉帕米等的轉(zhuǎn)運蛋白[14]。Anguizola等[15]建立了一種包封α1-AGP為固定相用以研究藥物與α1-AGP的相互作用的方法。通過在肼活化的多孔二氧化硅中對AGP進行物理包封并用氧化糖原作為封蓋劑。并對該條件進行檢驗和優(yōu)化。在pH 7.4和37 ℃動態(tài)條件下測定卡馬西平在AGP-硅膠固定相上吸附等溫線，從而得出結(jié)合平衡常數(shù)及結(jié)合的位點數(shù)，結(jié)果AGP的結(jié)合平衡常數(shù)為(1.0±0.5)×105mol·L-1，與之前報道的值一致。相同的方法可以延伸到其他藥物-蛋白質(zhì)相互作用的研究，包括在高通量篩選藥物及相互作用關(guān)系的快速分析方面具有潛在應(yīng)用的價值。

1.2 受體類 受體是一類功能蛋白，是藥物發(fā)揮作用的主要靶點，通過受體特異性地識別、結(jié)合，通過信息傳導從而參與生理調(diào)控、神經(jīng)傳導等多種機體生理病理過程[16]。若將受體固載于固定相表面，把其特異性結(jié)合作用與色譜分離技術(shù)結(jié)合，就能建立一種快速篩選藥效物質(zhì)的方法[17]，在此色譜柱中可保留能與受體特異性結(jié)合的中藥活性組分，而無保留行為的物質(zhì)流出，活性篩選和色譜分離兩種模式可同時進行?；诟哂H和力固定化受體的色譜法有望成為確認藥物靶標和藥物受體相互作用分析的替代方法。

1.2.1 α1-腎上腺素受體 α1-腎上腺素受體(α1-adrenergic receptor，α1-AR)參與機體的許多重要的生理活動，由于α1-AR主要是影響心血管系統(tǒng)，因此可以用來篩選對心血管系統(tǒng)有效應(yīng)的活性物質(zhì)[18]。王雪艷[19]建立了一種α1A-腎上腺素配體的分子生物色譜法，并用其對紅花進行研究，確定了羥基紅花黃色素A是紅花中與 α1A-AR有特異性結(jié)合的活性成分，該結(jié)果表明羥基紅花黃色素A可能對心血管系統(tǒng)有作用，有后期繼續(xù)研究的價值，這為中藥藥效成分篩選提供新思路。

1.2.2 β2-腎上腺素受體(β2-adrenergic receptor，β2-AR) β2-AR為G蛋白偶聯(lián)受體超家族的一員，是治療呼吸系統(tǒng)疾病的重要靶點[20]。為了篩選紅景天中具有多重作用靶點的生物活性成分，Liu等[21]將純化的β2-AR和電壓依賴性陰離子通道亞型1(voltage dependent anion channel isoform 1，VDAC-1)受體同時固定在氨基酸微球表面，紅景天水提物過柱分離后，保留成分經(jīng) HPLC-ESI-Q-TOF-MS鑒定是大花紅天素和紅景天苷。多索茶堿是一種黃嘌呤衍生物，在臨床上被認為是治療哮喘的主要藥物，Zhang等[22]采用高效親和層析法研究β2-AR和多索茶堿之間的相互作用研究。固定在硅膠的β2-AR運用在前沿分析、非線性層析等色譜方法，并通過探索位點研究其結(jié)合機理。非線性色譜結(jié)果中多索茶堿與固定化β2-AR結(jié)合的結(jié)合常數(shù)為7.70×104mol·L-1，表明β2-AR是多索茶堿作用的靶點，前沿色譜中結(jié)合常數(shù)的結(jié)果為5.91×104mol·L-1，證明多索茶堿和β2-AR只有一種類型的結(jié)合位點，分子對接結(jié)果顯示，多索茶堿與β2-AR結(jié)合是氫鍵作用介導，β2-AR第5個跨膜域的Ser169和Ser173是受體-藥物相互作用過程中氫鍵形成的結(jié)合位點。該實驗也證實了固定化β2-AR在篩選未知藥物或擴大藥物新作用方向的可行性。

1.2.3 過氧化物酶體增殖物激活受體 過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs) 屬于配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子核受體,有α、δ及γ 3種異構(gòu)形式[23]。其中PPARγ是研究較多的受體，是調(diào)控內(nèi)分泌代謝的重要因子[24]。在多種細胞中均有表達，可參與糖尿病、腫瘤、動脈粥樣硬化等體內(nèi)眾多疾病的調(diào)節(jié)，是治療眾多疾病的潛在靶點[25]。Zhou等[26]建立PPARγ/DNA折紙生物色譜法，用于從復雜成分中篩選PPARγ拮抗劑。將人參總皂苷進入PPARγ/DNA柱，其中R0為無保留行為組分，而R1組分在該柱上被保留，這兩種組分分別經(jīng)過 HPLC 和 HPLC/MS分析。結(jié)果表明，人參皂苷 Re是從總皂苷中分離可與PPARγ結(jié)合的活性分子。利用PPARγ/DNA折紙生物色譜模型特定的識別結(jié)合復雜體系的化合物可以有效地篩選目標成分，并通過高效液相色譜/質(zhì)譜系統(tǒng)準確鑒定。這將有助于中藥及復方中物質(zhì)基礎(chǔ)的快速篩選。

1.3 酶 在藥物篩選中，酶是最大的目標系統(tǒng)，許多酶模型在藥物研發(fā)過程中發(fā)揮重要作用，實際上許多市售藥物的藥理活性均屬于酶抑制劑，目前許多新藥開發(fā)仍然以酶抑制劑為研究對象[27]。酶通過吸附、共價鍵結(jié)合、交聯(lián)、包埋等方法固定于載體上，以此尋找某些酶的抑制劑或激動劑，為多種疾病如腫瘤、糖尿病、肝炎等提供治療依據(jù)。因此以酶為固定相填料的MBC將在藥效成分篩選中發(fā)揮更大的作用[28]。Luo等[29]使用模擬C型肝炎病毒的蛋白酶固載在固定相上，結(jié)合質(zhì)譜快速篩選復雜體系中的C型肝炎病毒的蛋白酶抑制劑，實驗發(fā)現(xiàn)葉下珠屬草本類植物提取物中酚酸類物質(zhì)在C型肝炎病毒的蛋白酶柱上具有保留行為，通過質(zhì)譜鑒定證實其中的云實素具有活性，從而建立起一種從天然產(chǎn)物中高通量篩選高效低毒的治療C型肝炎病毒的活性成分的新方法。

1.4 DNA DNA是很多藥物的作用靶點如抗菌、抗腫瘤、抗病毒等，藥物小分子可與DNA通過嵌插作用、溝槽結(jié)合、靜電結(jié)合、長距組裝等相結(jié)合，由于溝槽結(jié)合和嵌插不會影響 DNA 的結(jié)構(gòu)而影響其活性，因此DNA通過上述方式構(gòu)建MBC ，以此篩選天然產(chǎn)物中的活性物質(zhì)[30-31]。Su等[32]以小牛胸腺 DNA為固定相，作為一維色譜分離黃連、黃柏和苦參中的活性成分，而為二維色譜ODS 柱色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，對一維色譜的粗產(chǎn)物進行分離分析鑒定，實現(xiàn)了中藥復雜樣品的高效分離和活性成分篩選鑒定一體化流程。

1.5 核心組蛋白 核心組蛋白存在于真核細胞核小體中間N-末端，會以多種方式穿過而暴露于核心顆粒外，暴露的組蛋白 N-端尾部可進行多種共價修飾從而影響基因轉(zhuǎn)錄的激活、沉默、DNA 損傷修復等重要生物學過程[33]。對組蛋白修飾的下游生物學反應(yīng)的研究表明，組蛋白相互作用蛋白是一種潛在的基因轉(zhuǎn)錄水平的抗癌藥物開發(fā)靶蛋白。蔡漢寧等[34]建立以核心組蛋白 MBC，進行復雜組分的分析，使之成為表征與靶分子組蛋白相互作用蛋白的探針，篩選出9 種組蛋白作用蛋白。

2 中藥研究中的應(yīng)用

2.1 分離鑒定中藥的活性成分 分子生物色譜作為一種體外活性篩選技術(shù)，在中藥藥效物質(zhì)分離研究中被廣泛應(yīng)用。王芳煥等[35]將羰基咪唑活化的氨丙基硅膠與HSA進行結(jié)合，以此作為生物色譜填料，并用元素分析的方法考察鍵合效率，根據(jù)氮元素和碳元素質(zhì)量分數(shù)的變化量計算出HSA占填料質(zhì)量的8.16%，判斷出HSA 已被鍵合到硅膠表面。將鐵棒錘總生物堿提取液過柱分離，獲得的HSA柱的保留組分，所得組分經(jīng)反相液相色譜-離子阱多級質(zhì)譜聯(lián)用分析，從中鑒定4種活性物質(zhì)，獲得了較好的分離結(jié)果。Wang等[36]建立了重組β2-AR親和層析色譜聯(lián)合飛行時間質(zhì)譜在線檢測的方法，用于從天然植物提取物、中藥等復雜體系中尋找β2-AR配體。實驗中流動相選擇2.5 mmol·L-1Tris - HCl,0.5 mol·L-1MgCl2和0.25 mol·L-1乙二胺四乙酸，從活血膠囊水提物中鑒定出阿魏酸、羥色胺黃A和柚皮苷是與β2-AR特異性結(jié)合的具有生物活性的化合物。該方法可以同時識別、分離和鑒定多種生物活性物質(zhì)，可以用于中藥及天然藥物中生物活性化合物的高通量篩選。

2.2 中藥與受體/血漿蛋白的相互作用關(guān)系 研究功能蛋白大分子與藥物分子相互作用對于藥物開發(fā)及應(yīng)用來說，至關(guān)重要。其相互作用的研究將有助于闡明生物體內(nèi)藥物的作用過程和新藥開發(fā)[37]。受體生物色譜不僅能判定藥物在體內(nèi)的作用靶點，還可以研究藥物與受體的作用強度以及與其他藥物的競爭作用。蔡曉明等[38]將HSA蛋白鍵合硅膠表面作為固定相并填成色譜柱，測定藥物與蛋白的結(jié)合率，其原理是計算藥物在該色譜柱上與空白硅膠柱上的保留時間差得到。以華法令為模型化合物對比HSA MBC與傳統(tǒng)超濾法測得的結(jié)合率，結(jié)果在統(tǒng)計學上沒有差異，在此基礎(chǔ)上測定了葛根素和告依春兩種中藥成分與HSA的相對結(jié)合率，結(jié)果分別為10.26%和10.20%。芍藥甘草湯被廣泛用于治療肌肉痙攣和哮喘，但其中的藥效物質(zhì)及機制并不清楚，Li等[39]使用固定化β2-AR色譜分離結(jié)合飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定芍藥甘草湯水提物。發(fā)現(xiàn)芍藥苷和甘草苷是其中具有生物活性的化合物。結(jié)合β2-AR前沿色譜的分析，芍藥苷和甘草苷與β2-AR只有一個結(jié)合位點,且計算出結(jié)合常數(shù)分別為 (2.16±0.10)×104、(2.95±0.15)×104mol·L-1。

2.3 質(zhì)量控制 將分子生物色譜應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制的方法學研究，根據(jù)色譜活性成分的篩選結(jié)果，建立有效的指紋分析質(zhì)量控制方法。對于一些有效成分尚不清楚的中藥，可以利用其指紋分析法進行快速的質(zhì)量監(jiān)控[3]。Wang等[40]將硅膠鍵合HSA柱和反相 HPLC 柱聯(lián)合使用，作為二維生物色譜應(yīng)用于分析中藥復方龍膽瀉肝湯中生物活性成分的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)有100多種活性成分可以與HSA柱結(jié)合，根據(jù)保留時間，結(jié)合其他檢測方法所提供的信息，鑒定出19種成分。

3 結(jié)語

MBC作為一種體外活性篩選技術(shù)，具有重現(xiàn)性好、分析速度快、具有藥理學意義等特點，在中藥研究方面有很大的發(fā)展空間和良好的發(fā)展前景。對于中藥材及復方制劑而言，選擇不同生物大分子作為固定相配基，MBC在中藥活性成分篩選、作用關(guān)系研究、靶標確認等方面可發(fā)揮重要作用。但同時也存在模擬體內(nèi)環(huán)境不完全、制備固定相困難、使用色譜柱壽命短和處理量小等亟待解決的問題[41]。相信通過多學科交叉、新技術(shù)、新材料的應(yīng)用等手段將極大地擴大MBC的使用范圍，為中醫(yī)藥的發(fā)展做出更大的貢獻。