蔣興旺，閆 強(qiáng)，張尚鑫，孫若川，李德關(guān)，魯明典，張 震，李永翔

胃癌發(fā)病率在我國(guó)連年居高不下，是我國(guó)第二大常見腫瘤[1]，要降低胃癌的總體死亡率，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療是非常重要的，而早期胃癌并無(wú)明顯癥狀，多數(shù)患者就診時(shí)已是中晚期。手術(shù)治療是胃癌的首選治療方式，但對(duì)于中晚期患者，手術(shù)預(yù)后不佳。泛素化是人體內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)，能夠介導(dǎo)膜蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控因子、轉(zhuǎn)錄因子、癌蛋白和抑癌蛋白等底物蛋白的降解、穩(wěn)定和重定位，該過(guò)程受到激活酶(E1s)、結(jié)合酶(E2s)及蛋白酶(E3s)的嚴(yán)密調(diào)控。泛素化在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各方面都發(fā)揮著重要作用，該過(guò)程的紊亂可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生腫瘤或其他疾病[2]。

神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)樣基因4(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated 4 like，NEDD4L)又稱Nedd4-2，屬于E3泛素連接酶Nedd4家族，NEDD4L可作用于上皮鈉通道(ENaC)，協(xié)助維持體內(nèi)鈉平衡、維持血壓等[3]。已有研究[4-5]表明NEDD4L在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，但其在胃癌中的作用尚不明確。該研究通過(guò)檢測(cè)胃癌組織、癌旁正常組織中NEDD4L的表達(dá)情況及其與胃癌患者的預(yù)后、分化程度、浸潤(rùn)深度和TNM分期等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，以分析其對(duì)臨床判斷胃癌預(yù)后的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1病例資料胃癌組織標(biāo)本中用于免疫組化的標(biāo)本收集自2006年12月～2008 年9月醫(yī)院普外科手術(shù)切除組織，術(shù)后病理明確診斷為胃癌，均具有完整的病理與相關(guān)隨訪資料。共包含124例胃癌組織與25例隨機(jī)選取的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)，將組織樣本制作成組織芯片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。其中男96例，女28例；年齡29～80歲，平均60.86歲，中位年齡60歲，≥61歲有63例，<61歲有61例；腫瘤直徑≥6 cm有83例，<6 cm有41例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性有83例，陰性有41例；腫瘤浸潤(rùn)深度較淺的(T1和T2)有26例，較深的(T3和T4)98例；根據(jù)第七版AJCC (the American Joint Committee on Cancer)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期72例。另收集2016年8～10月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科手術(shù)切除的25對(duì)新鮮胃癌及配對(duì)癌旁正常組織標(biāo)本(距腫瘤邊緣>5 cm)，-80 ℃保存待用，所有患者均被告知并簽署知情同意書，實(shí)驗(yàn)方案得到醫(yī)院倫理委員會(huì)審核及批準(zhǔn)。

1.2主要試劑和儀器TRIzol(上海翊圣生物科技公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(日本Toyobo公司)；NEDD4L抗體(美國(guó)Proteintech Group公司)；二抗(上海碧云天生物技術(shù)公司)；Western blot 化學(xué)發(fā)光液(美國(guó)Millipore公司)。384孔PCR板；7900H型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.3方法

1.3.1定量PCR 取適量胃癌和癌旁正常組織提取mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA,以此作為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，以β-actin作為內(nèi)參，NEDD4L F：5′-TCC AATGGTCCTCAGCTGTTTA-3′，R: 5′-ATTTTCCACG GCCATGAGA-3′；β-actin F：5′-CTCCATCCTGGCCTC GCTGT-3′，R: 5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′，反應(yīng)條件設(shè)置如下:95 ℃變性10 min，然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，以上三步進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所用儀器為美國(guó) Applied Biosystems(ABI)公司7900H型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，使用384孔定量板作為反應(yīng)容器，每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)復(fù)孔。目的基因的相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.2Western blot 提取胃癌和癌旁正常組織中的總蛋白，然后經(jīng)過(guò)上樣、電泳(80 V電泳30 min后換110 V電泳約1 h 30 min)、轉(zhuǎn)膜(0.3 A，1 h 30 min)、封閉(5%脫脂牛奶封閉液)、孵育(一抗稀釋比1 ∶1 000，二抗稀釋比1 ∶5 000)、顯影(AB液按1 ∶1配制)后，采用image J軟件分析目的條帶與β-actin的灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3免疫組化 石蠟標(biāo)本切成4 μm厚的切片，然后經(jīng)過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)、孵育一抗、孵育二抗、顯色、封片后，在顯微鏡下觀察，采用免疫反應(yīng)積分法(IRS)[即染色強(qiáng)度(SI)與陽(yáng)性細(xì)胞百分率(PP)的乘積評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分按陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比例評(píng)分，分為四級(jí)：≤25%(1分)；26%～50%(2分)；51%～75%(3分)；>75%(4分)。染色強(qiáng)度評(píng)分，共四級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)色(-，0分)；淡黃色(+，1分)；棕黃色(++，2分)；棕褐色(+++，3分)。為便于分析結(jié)果，按IRS分?jǐn)?shù)將結(jié)果分為兩組，分別為[IRS≤2，低表達(dá)(陰性)組]和[IRS>2，高表達(dá)(陽(yáng)性)組]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間均數(shù)比較，NEDD4L表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的分析采用Pearson χ2檢驗(yàn)，生存曲線分析采用Kaplan-Meier法，并采用Log-Rank檢驗(yàn)，采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NEDD4L在胃癌和癌旁正常組織中低表達(dá)定量PCR結(jié)果顯示，在多數(shù)(72%，18/25)的胃癌組織中，NEDD4L mRNA水平均明顯低于其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織(P<0.05)；蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果顯示NEDD4L在胃癌組織的平均灰度值(0.55±0.49)明顯低于癌旁正常組織(1.27±0.51)(t=0.012 5,P<0.01)，見圖1；免疫組化結(jié)果顯示NEDD4L蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖2，且NEDD4L在胃癌組織標(biāo)本中的陽(yáng)性率為45.97%(57/124)明顯低于癌旁正常組織標(biāo)本的72%(18/25)(χ2=5.64,P<0.05)。

圖1 NEDD4L在胃癌組織(T)和癌旁組織(N)中mRNA和蛋白表達(dá)A、B：NEDD4L在胃癌組織和癌旁組織中mRNA的相對(duì)表達(dá)量；C：NEDD4L在8對(duì)(1～8)胃癌組織(T)和癌旁組織(N)中蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖2 胃癌組織和癌旁組織中NEDD4L的免疫組化結(jié)果 ×200

A：低分化胃癌組織；B：中分化胃癌組織；C：高分化胃癌組織；D：癌旁正常組織

2.2NEDD4L在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系胃癌組織中NEDD4L蛋白的表達(dá)與分化程度(P<0.05)、浸潤(rùn)深度(P<0.05)和臨床TNM分期(P<0.05)顯著相關(guān)，而與其他病理參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性，見表1。

2.3生存分析Kaplan-Meier生存分析表明浸潤(rùn)深度、腫瘤大小、臨床TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及NEDD4L的表達(dá)水平均與胃癌患者預(yù)后生存期相關(guān)，見表2；高表達(dá)NEDD4L的患者其平均生存時(shí)間(mean survival time,MST)要明顯高于低表達(dá)NEDD4L的患者(59.1個(gè)月vs37.7個(gè)月，P<0.001)，見圖3；單因素Cox回歸分析表明浸潤(rùn)深度、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)以及NEDD4L的表達(dá)水平均與胃癌患者生存期密切相關(guān)；多因素Cox回歸模型分析結(jié)果表明NEDD4L的表達(dá)水平(HR=0.467，95%CI：0.260～0.838，P<0.05)是胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素，見表3。

表1 胃癌組織中NEDD4L的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

表2 胃癌病理參數(shù)與患者預(yù)后關(guān)系的分析

3 討論

近年來(lái)有多項(xiàng)研究表明，NEDD4L在腫瘤的發(fā)展中扮演著重要角色。Hu et al[6]報(bào)道NEDD4L在前列腺癌組織中低表達(dá)，而且NEDD4L表達(dá)降低和腫瘤的侵襲性正相關(guān)。He et al[7]發(fā)現(xiàn)NEDD4L的下調(diào)在惡性腦膠質(zhì)瘤中和腫瘤的侵襲性增強(qiáng)以及患者的不良預(yù)后相關(guān)。在肺癌以及肝癌也發(fā)現(xiàn)類似情況[8-9]。Gao et al[10]發(fā)現(xiàn)NEDD4L在胃癌組織中的低表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，但該研究樣本量相對(duì)較小，且未包含正常對(duì)照，臨床意義有限。

圖3 NEDD4L表達(dá)與胃癌患者術(shù)后生存期的生存曲線分析

本研究結(jié)果顯示NEDD4L在胃癌組織中的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平相對(duì)于癌旁正常組織明顯降低，提示NEDD4L基因的低表達(dá)或許參與胃癌發(fā)生過(guò)程；大樣本量組織芯片的免疫組化結(jié)果也顯示NEDD4L在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照，臨床病理參數(shù)分析表明腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度和臨床TNM分期均與NEDD4L蛋白的表達(dá)顯著相關(guān)，提示NEDD4L可能與胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲密切相關(guān)，在胃癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用；生存分析結(jié)果表明NEDD4L的下調(diào)與胃癌患者較短的生存期顯著相關(guān)，NEDD4L高表達(dá)是胃癌患者良好預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

表3 臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的Cox回歸分析

本研究雖然探討了NEDD4L在胃癌和癌旁正常組織中的表達(dá)差異及NEDD4L表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，但是并沒有深入研究其作用的內(nèi)在分子機(jī)制，關(guān)于NEDD4L在腫瘤中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制，目前相關(guān)報(bào)道有限，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NEDD4L在胃癌組織中的表達(dá)與腫瘤組織分化程度、浸潤(rùn)深度和臨床TNM分期負(fù)相關(guān)，而且NEDD4L高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后較好，這表明NEDD4L在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用，隨著研究的深入，NEDD4L有可能作為胃癌診斷和治療的新靶標(biāo)。