牛緒東 馬梓承 李克鑫 李克欽 張春瑋 胡棟 張?jiān)?劉建柱*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院

2.山東德信生物科技集團(tuán)

3.濟(jì)南鑫寶星動(dòng)物藥業(yè)有限公司

豬瘟（CSF）是由微RNA病毒目黃病毒科瘟病毒屬豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、熱性、高度傳染性疾病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定通報(bào)的疫病，也是我國自2007年以來一直實(shí)行強(qiáng)制免疫的一類傳染病，是威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。近幾年，在臨床上時(shí)常發(fā)生非典型豬瘟。作者于2018年4月28日接診一例來自泰安市某養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的已注射過豬瘟疫苗的豬群，發(fā)生了與典型豬瘟不全一致的非典型豬瘟的病例。通過實(shí)驗(yàn)室檢查，從而得到確診，現(xiàn)總結(jié)如下。

（一）發(fā)病情況

畜主在2018年春節(jié)后于一個(gè)月內(nèi)分四批陸續(xù)從周圍不同的地區(qū)購進(jìn)119頭15～40 kg體重的豬，進(jìn)場后便陸續(xù)分別間隔免疫注射某廠家的豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）、O型口蹄疫疫苗、圓環(huán)病毒滅活苗和偽狂犬疫苗。最近一個(gè)多月開始陸續(xù)發(fā)病和死亡，邀請(qǐng)多名獸醫(yī)給予診治，曾按附紅細(xì)胞體病和弓形體病治療，曾用磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、土霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、雙黃連和黃芪多糖等藥物進(jìn)行治療，均無明顯效果。畜主來山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院10 d前曾注射了兩個(gè)廠家的豬瘟細(xì)胞苗（注：因原來廠家的疫苗暫時(shí)缺貨，故購買了另一廠家的豬瘟疫苗），其中，大約半數(shù)豬只注射了原來廠家的疫苗，但是現(xiàn)在仍繼續(xù)發(fā)病和死亡；剩余的半數(shù)豬注射了另一廠家的疫苗后僅個(gè)別死亡，現(xiàn)已趨于穩(wěn)定。到畜主來診之時(shí)，據(jù)統(tǒng)計(jì)已死亡29頭，仍有36頭發(fā)病。經(jīng)作者診斷處理后一周內(nèi)，比較嚴(yán)重者又死亡9頭，未見新發(fā)病例。病情穩(wěn)定后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率是 54.62%（65/119）、死亡率為31.93%（38/119）、病死率為58.46%（38/65）。

（二）臨床癥狀

病豬表現(xiàn)營養(yǎng)不良，飲食欲減退或廢絕，逐漸消瘦和貧血；可視粘膜及皮膚蒼白，被毛無光澤，皮膚皸裂（見圖1），有的皮膚上可見出血點(diǎn)；多數(shù)腹瀉，排灰白色或灰黃色稀便，有的排“算盤珠樣”的干糞，表面附有黏液（見圖2）；個(gè)別出現(xiàn)嘔吐現(xiàn)象；輕度咳嗽和氣喘，有的流鼻涕；體溫多在40℃～41℃之間；后期有的可見耳朵發(fā)紫，拉稀者死亡快，病程多在一周之內(nèi)，排干糞者病程可延至2～3周。

圖1 病豬表現(xiàn)消瘦、貧血、皮膚皸裂

圖2 病豬多數(shù)拉稀，有的拉干糞

（三）病理剖檢

尸體表現(xiàn)貧血蒼白（見圖3）；全身淋巴結(jié)腫脹，呈現(xiàn)“大理石樣”花紋的周邊出血現(xiàn)象（見圖4），體表淋巴結(jié)周圍可見淡黃色水腫（見圖5）；心外膜輕度出血，心冠脂肪水腫（見圖6）；雙側(cè)扁桃體腫脹、潮紅（見圖7）；尿液呈淡黃色，膀胱黏膜有少量出血點(diǎn)；脾臟輕度腫大，可見少量出血性梗死灶；腎臟貧血呈土黃色，其上可見多量針尖狀出血點(diǎn)（見圖8）；氣管及支氣管內(nèi)出現(xiàn)泡沫狀液體和少量黏痰（見圖9），肺臟淤血、出血、水腫（見圖10）；肝臟輕度腫大和淤血，膽囊擴(kuò)張，膽汁濃稠內(nèi)含多量顆粒狀物（見圖11）；胃底腺區(qū)輕度出血，賁門腺區(qū)呈現(xiàn)明顯出血（見圖12）；腸道輕度出血，大腸黏膜輕度水腫。

圖3 尸體表現(xiàn)貧血蒼白

圖4 腸系膜淋巴結(jié)腫脹，呈現(xiàn)周邊出血

圖5 腹股溝淋巴結(jié)周圍可見淡黃色水腫

圖6 心外膜輕度出血，心冠脂肪水腫

圖7 雙側(cè)扁桃體腫脹、潮紅

圖8 腎臟貧血性出血

圖9 氣管及支氣管內(nèi)有泡沫狀液體和黏痰

圖10 肺臟淤血、出血和水腫

圖11 膽汁濃稠內(nèi)含多量顆粒狀物

圖12 賁門腺區(qū)出血

（四）實(shí)驗(yàn)室診斷

分別采集病死豬的肺臟、淋巴結(jié)和脾臟，以備病料中四種病毒基因組的提取。

對(duì)CSFV進(jìn)行RT-PCR檢測。凍存于液氮中的組織病料（脾臟和淋巴結(jié)）解凍后取適量加入滅菌PBS并研磨成勻漿，10000 rpm離心4 min后取上清，使用北京全式金EasyPure Viral DNA/RNA kit 提取病毒核酸。根據(jù)GenBank中已發(fā)布的CSFV序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的片段為599 bp，上游引物序列：F-TRACCAYGCAYATGWCAGAAGTACC；下游引物序列：R-AGTCGACTTCCCTGGTTTCACTTG。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，采用 20 μl PCR 體 系：DNA 樣本 3 μl，R-Mix 10 μl；E-Mix 0.3 μl；上下游引物各 1 μl；滅菌ddH2 o 4.7 μl。PCR 程 序：94 ℃5 min；94℃ 30 s、57℃ 40 s、72℃30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，該病料中CSFV核酸出現(xiàn)目的條帶（見圖13）。

筆者也對(duì)PRRSV和PRV、PCV2用病料中的肺臟和淋巴結(jié)，按照RNA/DNA提取試劑盒（購自上海生工生物公司）說明書分別進(jìn)行了RT-PCR和PCR技術(shù)檢測。這三種病毒的特異性引物均由北京偉嘉集團(tuán)山東檢測中心提供。分別進(jìn)行了PCR特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小 分 別為 432 bp、292 bp、785 bp。經(jīng)過一系列步驟的嚴(yán)格操作，PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，在該病料中PRRSV、PRV和PCV2核酸均未出現(xiàn)目的條帶。

從左至右 M：DL 2 000 DNA marker；“＋”泳道依次為豬瘟、藍(lán)耳、偽狂犬和圓環(huán)病毒的陽性對(duì)照；

“－”泳道依次為豬瘟、藍(lán)耳、偽狂犬和圓環(huán)病毒的陰性對(duì)照；

“1”泳道依次為豬瘟、藍(lán)耳、偽狂犬和圓環(huán)病毒的樣品。

圖13 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

（五）結(jié)論

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理剖檢，作者初步診斷為CSFV和PCV2的混合感染性疾病。經(jīng)（RT）PCR檢測了4種病毒后得知，PRRSV、PRV和PCV2為陰性，僅CSFV為陽性，故該病例最終確診為CSFV的單一感染。

（六）討論與小結(jié)

1.發(fā)病原因。該豬場發(fā)生非典型豬瘟主要有以下幾個(gè)原因，一是豬場原來使用的豬瘟疫苗可能存在問題，按常規(guī)跟胎免疫注射卻沒有阻斷住CSFV的侵襲，當(dāng)懷疑有豬瘟后，畜主可能又使用了由于保存不當(dāng)或原本就質(zhì)差的疫苗對(duì)部分豬進(jìn)行了緊急免疫，所以這部分豬才沒有被快速控制住本病的發(fā)生；其次是診斷不及時(shí)，延誤了緊急免疫注射的最佳時(shí)間，造成豬場病毒量急增且長時(shí)間被污染，從而引發(fā)病情加重，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失；三是畜主自認(rèn)為該豬場是個(gè)小型豬場，又遠(yuǎn)離村鎮(zhèn)和其他養(yǎng)殖場，所以衛(wèi)生消毒意識(shí)淡薄，每天只清掃豬舍很少進(jìn)行大面積的衛(wèi)生消毒工作，從而造成病原微生物的滋生與侵襲；四是，是否與飼料營養(yǎng)不全或存在霉菌毒素有關(guān)（有待進(jìn)一步分析），使機(jī)體的免疫力降低，從而給CSFV的侵襲提供了方便。

2.處理方案及效果。該病例達(dá)到后，筆者于48 h內(nèi)及時(shí)給予確診，制定如下防制方案。（1）無害化深埋處理病死豬；（2）把免疫失敗的豬群再重新按3倍量緊急免疫注射質(zhì)量好的豬瘟細(xì)胞苗；（3）注射疫苗3 d后，豬場內(nèi)外進(jìn)行全面衛(wèi)生消毒，1次 /d，連續(xù) 3 d，以后每 10 d 左右一次。環(huán)境消毒用3%的熱火堿溶液，舍內(nèi)帶豬消毒用1∶800的三氯異氰尿酸鈉溶液；（4）飼料內(nèi)加入5天的氟苯尼考、復(fù)合VB和VC，主要是防止繼發(fā)感染和增強(qiáng)機(jī)體免疫力；（5）飼喂易消化的全價(jià)日糧，清除霉敗變質(zhì)的飼料，供給清潔飲水。

半月后回訪，經(jīng)采取上述處理措施一周后未見新病例出現(xiàn)，豬群健康基本趨于穩(wěn)定。因此，對(duì)該豬瘟病例的防制取得了比較滿意的可靠效果。

3.免疫監(jiān)測。有條件的養(yǎng)豬企業(yè)，在注射豬瘟疫苗之前應(yīng)先檢測其效價(jià)是否達(dá)到免疫注射標(biāo)準(zhǔn)，以防止因疫苗質(zhì)量問題而影響免疫效果，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

免疫效果要通過免疫一周后進(jìn)行抗體檢測來確定。按生物統(tǒng)計(jì)的方法，最少應(yīng)采集檢測所免疫豬群的頭數(shù)為（n代表免疫豬群總頭數(shù)）頭的血清，方可代表全群免疫的效果。如果免疫后抗體水平按PPA-ELSIA檢測抗體法，OD490值達(dá)到0.3以上；按IHA檢測抗體法，抗體滴度應(yīng)大于6 log2，方可說明這次免疫的效果優(yōu)良。否則，應(yīng)更換疫苗效價(jià)達(dá)到免疫注射標(biāo)準(zhǔn)的豬瘟疫苗再重新進(jìn)行免疫注射，免疫注射一周后再檢測免疫效果，直至抗體水平達(dá)到保護(hù)要求為止。

4.非典型豬瘟的免疫。根據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，目前我國許多地區(qū)的豬場雖然進(jìn)行了豬瘟疫苗免疫，但仍然有部分豬群的免疫抗體低下，有的甚至只有20%的免疫合格率，這就說明了豬瘟疫苗免疫失敗的原因主要有豬瘟病毒的持續(xù)性感染、混合感染、母源抗體干擾、免疫程序不當(dāng)及疫苗質(zhì)量問題等多個(gè)方面。

5.非典型豬瘟的診斷要點(diǎn)。臨床上主見拉稀、貧血、漸瘦。特征性剖檢變化為全身淋巴結(jié)腫脹并呈現(xiàn)紅白相間的“大理石樣”周邊出血的現(xiàn)象，腎臟貧血性出血及膽汁濃稠等。根據(jù)以上特點(diǎn)，臨床上可初步診斷為非典型豬瘟，確診需要實(shí)驗(yàn)室檢查如通過PCR技術(shù)檢測到病原。

6.綜合防控。目前，CSFV的感染率仍然較高，并時(shí)常引發(fā)臨床表現(xiàn)，需要引起畜牧獸醫(yī)工作者的高度重視。養(yǎng)殖場要制定并嚴(yán)格執(zhí)行科學(xué)有效的生物安全措施，把好疫苗質(zhì)量關(guān)，及時(shí)按科學(xué)程序免疫，定期做好監(jiān)控，及時(shí)搞好衛(wèi)生消毒等各項(xiàng)具體工作。