李桂黎，岳建國，李敏，周瀟瀟，李俐睿，肖金鵬，向曉雪

（四川省成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

熒光定量PCR（FQ-PCR）方法是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一種核酸定量檢測技術(shù)[1]。FQ-PCR在動(dòng)物疫病檢測過程中的發(fā)展非常迅速，因特異性高、操作簡便、污染少、耗時(shí)短等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[2]。本文對(duì)FQ-PCR法與其他三種常見病原檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較分析。

1 FQ-PCR與普通PCR的比較

1.1 材料

1.1.1 樣品 4份傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）的組織勻漿樣品及陽性對(duì)照樣品，均由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所提供。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、ddH2O、DNA Marker（DL2000），均購自天根公司；蝦類傳染性皮下及造血組織壞死病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，購自金瑞鴻捷（廈門）生物科技公司。

1.1.3 主要儀器 PCR儀（ABI 2720），電泳儀（DYY-8C），一體化凝膠成像儀（SmartGel），熒光定量PCR儀（杭州博日LineGene9660）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 各取100μL樣品和陽性對(duì)照品，以100 μL ddH2O為陰性對(duì)照，按照DNA提取試劑盒所述方法提取樣品和對(duì)照品的DNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 普通PCR檢測 根據(jù)國標(biāo)（GB/T 25878-2010）對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測PCR法[3]，建立PCR反應(yīng)體系，引物序列（F：5'-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3'；R：5'-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3'）由成都擎科生物技術(shù)有限公司合成。每個(gè)反應(yīng)體系為 50μL，包括：2×Mix 25μL，引物 F 2μL，引物 R 2μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5min；95℃ 30 s，55℃ 30s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在一體化凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.2.3 FQ-PCR檢測 根據(jù)熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系。取2μL的核酸樣品、陽性對(duì)照品加入已添加了反應(yīng)試劑的反應(yīng)管內(nèi)。將配好的反應(yīng)體系放入熒光定量PCR儀上，反應(yīng)程序：42℃ 30min；93℃ 15s，60℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集熒光。反應(yīng)完成后直接讀取結(jié)果。

1.3 檢測結(jié)果

1.3.1 普通PCR檢測結(jié)果 如圖1顯示，對(duì)照成立。2號(hào)、3號(hào)樣品均有目的條帶出現(xiàn)，與陽性對(duì)照品的條帶一致；1號(hào)、4號(hào)樣品無目的條帶出現(xiàn)。

圖1 PCR反應(yīng)結(jié)果

圖2 熒光定量PCR檢測結(jié)果

1.3.2 FQ-PCR檢測結(jié)果 本次只進(jìn)行了定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。2號(hào)樣品出現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)S曲線，其Ct值為21.38；3號(hào)樣品也出現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)S曲線，Ct值為20.95；1號(hào)、4號(hào)樣品均未出現(xiàn)曲線。1.4 結(jié)果分析 普通PCR方法與FQ-PCR檢測方法均能對(duì)樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果較為可靠，兩者的符合率為100%。相較于普通PCR法，F(xiàn)QPCR法的檢測步驟少，檢測時(shí)間短。因此，F(xiàn)QPCR法在動(dòng)物疫病檢測中擁有更多的優(yōu)勢。

2 FQ-PCR與ELISA的比較

2.1 材料

2.1.1 樣品 52份犬唾液拭子樣品，從成都市青羊區(qū)采集得到。

2.1.2 主要試劑 狂犬病病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，購自哈爾濱世紀(jì)元亨生物技術(shù)有限公司；狂犬病抗原ELISA檢測試劑盒，購自Cedi Diagnostics公司。

2.1.3 主要儀器 熒光定量PCR儀（杭州博日LineGene9660），全波長酶標(biāo)儀（賽默飛）。

2.2 方法

2.2.1 ELISA檢測 根據(jù)狂犬病抗原ELISA試劑盒的操作步驟，以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

2.2.2 FQ-PCR檢測 取100μL樣品，利用狂犬病病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒提取樣品及陰性、陽性對(duì)照的RNA，將提取的RNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。按照該試劑盒說明配制20μL反應(yīng)體系進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)，體系包括：無菌無核酸酶水 5.2 μL，RT-PCR 反應(yīng)液 10 μL，酶混合液0.4μL，熒光探針1.4μL，模板RNA 3μL。反應(yīng)程序：45 ℃ 15 min，95℃ 1min；95℃ 5s，60℃35s，共40個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集熒光。反應(yīng)完成后直接讀取結(jié)果。

2.3 檢測結(jié)果

2.3.1 ELISA檢測結(jié)果 根據(jù)ELISA 450 nm波長的檢測結(jié)果，有5份樣品顯示為陽性，陽性率為9.6%，但是陽性樣品的吸光值均在臨界值附近，提示檢測出的陽性樣品可能為假陽性。

2.3.2 FQ-PCR檢測結(jié)果 如圖3所示，將52份犬狂犬病病毒RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測，結(jié)果顯示：陽性對(duì)照出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)S曲線，陰性對(duì)照及樣品均無S曲線出現(xiàn)。

2.4 結(jié)果分析 本次實(shí)驗(yàn)中兩種方法的符合率為90.4%。在應(yīng)用方面，ELISA檢測方法常用作抗體檢測，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法常用作病原檢測。

圖3 熒光定量PCR檢測結(jié)果

圖4 熒光定量PCR檢測結(jié)果

3 FQ-PCR與快速檢測卡的比較

3.1 材料

3.1.1 樣品 雞泄殖腔或咽喉拭子50份，源于成都市雙流區(qū)2017年度秋季重大動(dòng)物疫病防疫監(jiān)測抽樣。

3.1.2 主要試劑 禽流感通用型熒光定量PCR試劑盒，購自北京世紀(jì)元亨生物技術(shù)有限公司；禽流感快速檢測卡，購自深圳市康佰得生物科技有限公司。

3.1.3 主要儀器 熒光定量PCR儀（杭州博日LineGene9660）。

3.2 方法

3.2.1 快速檢測卡檢測 將快速檢測卡平衡至室溫后，按照說明書步驟對(duì)樣品進(jìn)行檢測，室溫放置10～15min后判讀結(jié)果。

3.2.2 FQ-PCR檢測 各取100μL樣品、陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品于1.5mL滅菌離心管中，按照試劑盒中病毒RNA的提取步驟提取模板RNA，于-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒說明配制20μL反應(yīng)體系：無菌無核酸酶水2.7μL，RT-PCR反應(yīng)液10μL，酶混合液 0.4 μL，熒光探針 1.9 μL，樣品 5 μL。配好體系后，在熒光PCR儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：45℃ 15min；95℃ 5s，60℃ 35s，共 40 個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集熒光。反應(yīng)完成后直接讀取結(jié)果。

3.3 結(jié)果

3.3.1 快速檢測卡檢測結(jié)果 根據(jù)禽流感病毒通用型抗原快速檢測卡產(chǎn)品說明書，檢測T線區(qū)及對(duì)照C區(qū)同時(shí)出現(xiàn)紅色線即判為陽性樣品，只有對(duì)照C區(qū)出現(xiàn)一條紅線為陰性樣品。本次共檢測樣品50份，結(jié)果有6份為疑似陽性樣品。

3.3.2 FQ-PCR檢測結(jié)果 如圖4所示，陽性對(duì)照有標(biāo)準(zhǔn)S曲線出現(xiàn)，陰性對(duì)照及樣品均無S曲線出現(xiàn)。

3.4 結(jié)果分析 本次實(shí)驗(yàn)中兩種方法的符合率為88.0%?？焖贆z測卡靈敏度較高，但特異性較差，檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性，適合大批量樣品的初篩。FQ-PCR檢測方法則適用于對(duì)快速檢測出的疑似陽性樣品進(jìn)行復(fù)核。

4 小結(jié)與展望

熒光定量PCR技術(shù)可用于多種病原微生物的檢測[4]，具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者通過將FQPCR與其他三種常用的疫病診斷方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)FQ-PCR法在動(dòng)物疫病病原檢測中具有獨(dú)特的優(yōu)勢：靈敏度高、特異性好、操作簡單，且用時(shí)較短、無毒無污染，適用于像動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心這樣的動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室的日常檢測工作。面對(duì)日益復(fù)雜的動(dòng)物疫病防控形勢，選擇一種快速準(zhǔn)確的疫病診斷方法非常重要。目前常見的動(dòng)物疫病如豬瘟、口蹄疫等都已經(jīng)有了熒光定量PCR檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)，市面上也有了成熟的熒光定量PCR檢測試劑盒。相信在不久的將來，熒光定量PCR檢測方法會(huì)更多地應(yīng)用于動(dòng)物疫病診斷，為有效防控動(dòng)物疫病帶來更多的便利。