王雪瑩，石 琳，程 志

(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450002)

嵌合抗原受體修飾T細胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)療法屬于腫瘤免疫療法，其通過提高腫瘤細胞的免疫原性，激發(fā)和增強機體抗腫瘤免疫應答，從而抑制或殺滅腫瘤細胞。2013年《Science》雜志將腫瘤免疫治療評選為“年度十大科學突破之首”[1]，2015、2016年美國臨床腫瘤學會年度進展報告中將腫瘤免疫治療列為“年度進展”[2-3]。近5 a來，CAR-T療法在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面取得了突出成績，對難治復發(fā)性急性B淋巴細胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)患者治療后的完全緩解(complete response,CR)率高達90%[4]，對難治復發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤患者治療后的總緩解率(overall response rate,ORR)達85%(該數(shù)據(jù)來源于恒潤達生在2018年12月美國ASH年會上發(fā)表的報告，試驗注冊號NCT03093168)。據(jù)相關文獻報道，截止2018年5月8日，全球已有550項CAR-T臨床試驗，其中美國212項，中國171項，歐洲89項[5]。但CAR-T治療后的脫靶效應、腫瘤復發(fā)等問題仍制約著其療效和安全性。本文就嵌合抗原體(chimeric antigen receptor,CAR)的結(jié)構(gòu)演變及CAR-T的抗腫瘤作用機制、在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的應用、目前面臨的問題和解決方案等作一綜述。

1 CAR的結(jié)構(gòu)演變

CAR由胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)與跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域3部分組成[6]，其結(jié)構(gòu)演變經(jīng)歷了一個不斷改進、不斷發(fā)展的過程。第1代CAR只有1個胞內(nèi)信號組分CD3ζ或者FcεRIγ分子[7]，只能引起短暫的T細胞增殖和較少的細胞因子分泌，體內(nèi)存活時間短，抗腫瘤效應弱。第2代CAR在第1代基礎上引入1個共刺激分子信號(如CD28、CD4-1BB等)[8-10]，提高了CAR-T的增殖能力和腫瘤細胞殺傷能力，延長了其在體內(nèi)的存活時間。大量臨床試驗和動物實驗表明，含有CD28共刺激分子的CAR-T可以維持T細胞的擴增[11-12]。第3代CAR是在原有設計上串聯(lián)2個免疫共激活信號分子(如4-1BB/CD28與CD3ζ結(jié)合)[13]。第4代CAR在第3代的基礎上增加了編碼CAR及其啟動子的載體[14]。

2 CAR-T的抗腫瘤作用機制

CAR-T的本質(zhì)是經(jīng)過基因工程技術修飾的T細胞，是從患者或供者的外周血中分離出單個核細胞或CD3+T細胞，在體外將針對腫瘤特異性抗原的抗原識別區(qū)和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域進行基因重組，通過慢病毒載體、睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、反轉(zhuǎn)錄病毒[15-17]等技術轉(zhuǎn)染患者的T細胞，將經(jīng)過純化、擴增的CAR-T回輸至患者體內(nèi)，短時間內(nèi)患者即可獲得自體的、可被腫瘤細胞激活的細胞毒性T細胞，其通過釋放細胞因子等達到靶向殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長的目的[18]。

正常情況下，T細胞發(fā)揮免疫功能受到主要組織相容性復合物( major histocompatibility complex,MHC) 的限制。MHC的限制性是指T細胞抗原受體識別抗原提呈細胞提呈的抗原肽時，必須同時識別抗原肽-MHCⅠ/Ⅱ分子復合物，也稱為T細胞的雙識別[19]。CAR-T細胞的優(yōu)勢在于它與抗原的結(jié)合不依賴于MHC的遞呈，而是通過單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)直接結(jié)合表面抗原，CAR可以通過CD3ζ和共刺激結(jié)構(gòu)域同時向T細胞傳遞信號，從而誘導T細胞的激活[20]。這一方式能有效避免因腫瘤細胞MHC表達下調(diào)發(fā)生的免疫逃逸。此外，每個CAR-T能夠殺滅大量腫瘤細胞[21]，并且可以通過抗原釋放、協(xié)助腫瘤浸潤性淋巴細胞攻擊腫瘤細胞、延長存續(xù)時間這3種方式加強免疫監(jiān)視，預防腫瘤復發(fā)[22-23]。

3 CAR-T療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的應用

3.1CAR-T療法在急性淋巴細胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)中的應用ALL是一種起源于單個B或T淋巴細胞前體細胞的惡性腫瘤，好發(fā)于兒童，中位發(fā)病年齡為13歲。而成人急性白血病中ALL僅占20%。隨著化學治療方案的不斷優(yōu)化，現(xiàn)階段兒童ALL的CR率可達98%，5 a 無病生存 (disease free survival，DFS)率達80%以上。成人ALL的CR率也可達80%以上[24]，但其長期生存率較低；兒童患者緩解后易復發(fā)，導致其病死率仍較高。

在難治復發(fā)性B-ALL的治療中，應用最多、療效最好的是靶向CD19的CAR-T。CD19是B細胞表面膜蛋白，廣泛表達于各個分化階段的B細胞(正常B細胞及B細胞惡性腫瘤細胞)表面，是B細胞腫瘤的理想靶點[25-26]。據(jù)相關文獻報道，目前已有350例難治復發(fā)性B-ALL患者在不同中心、不同國家參與回輸不同結(jié)構(gòu)CAR-T的臨床試驗[27]，CR率可達50%～90%[4]。2016年，美國國家癌癥研究所利用反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染以CD28為共刺激因子、以FMC63為scFv的CD19-CAR-T治療5例異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后復發(fā)的成人B-ALL患者，CR率達90%(4/5)，CR患者的微小殘留病變(minimal residual disease,MRD)均為陰性[27]。MAUDE等[28]給予75例兒童和年輕成人B-ALL患者輸注Kymriah(諾華批準上市的CAR-T產(chǎn)品)進行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，75例患者治療后6個月的無事件生存率和總生存率分別為73%和90%，治療后12個月的無事件生存率和總生存率分別為50%和76%。CHENG等[29]采用第2代CD19-CAR-T治療7例難治復發(fā)性B細胞白血病患者，其中5例(71%)達CR，2例中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病(central nervous system leukemia，CNSL)患者表現(xiàn)出持久的CR，持續(xù)時間>15個月。

3.2CAR-T療法在B細胞淋巴瘤中的應用淋巴瘤是一種異質(zhì)性很強的惡性腫瘤，病理類型十分復雜，疾病轉(zhuǎn)歸差異極大，目前已知的淋巴瘤有近70種病理類型。淋巴瘤在我國惡性腫瘤中發(fā)病率居第8位。根據(jù)國家癌癥中心2015年數(shù)據(jù)，我國每年新增淋巴瘤患者8.8萬人，每年病死人數(shù)6.8萬人，其中彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)約占45%[30]。

目前，淋巴瘤的治療仍以化學治療、放射治療和生物免疫治療的綜合治療方式為主，必要時可行造血干細胞移植。除少數(shù)局限期惰性非霍奇金淋巴瘤可采用局部放射治療外，多數(shù)患者應以聯(lián)合化學治療為主。近年來，以利妥昔單抗(抗CD20單克隆抗體)為代表的免疫治療在B細胞淋巴瘤中獲得突破性進展。CAR-T療法在治療B細胞淋巴瘤方面也取得了較好療效。2017年10月，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準Kite Pharma公司生產(chǎn)的Yescarta用于治療經(jīng)其他方法治療后無效或既往至少接受過2種方案治療后復發(fā)的特定類型的成人B細胞淋巴瘤，包括DLBCL、轉(zhuǎn)化型濾泡性淋巴瘤、原發(fā)縱隔B細胞淋巴瘤。

3.3CAR-T療法在多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)中的應用MM是漿細胞惡性增殖性疾病，由于存在微小殘留病變，在治療過程中無論MM達到何種程度的緩解，最終均會復發(fā)。MM是近2 a CAR-T治療的新熱點，常用的靶點有CD138、CD19、B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)等。

BCMA又稱CD269，屬于腫瘤壞死因子超家族，常表達于MM細胞、正常漿細胞及部分B細胞，免疫組織化學染色顯示BCMA在MM細胞上均勻表達[31]。ALI等[32]采用BCMA-CAR-T治療12例骨髓瘤患者，所有患者在接受該治療前至少接受了3個療程的化學治療，結(jié)果顯示，1例患者獲得嚴格意義的完全緩解，持續(xù)17周后復發(fā)，2例患者達到非常好的部分緩解，1例患者達到部分緩解，其余患者均病情穩(wěn)定。河南省中醫(yī)院應用BCMA-CAR-T治療11例難治復發(fā)性MM，其ORR達90.91%。

4 CAR-T療法面臨的問題及應對策略

4.1CAR-T治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應及應對策略

4.1.1細胞因子釋放綜合征(cytokinereleasesyndrome，CRS) CRS是由于CAR-T輸入體內(nèi)后，scFv的特異性抗體識別并結(jié)合腫瘤抗原，激活T細胞，導致大量炎性因子釋放，同時招募和激活體內(nèi)其他炎性細胞因子，引發(fā)全身炎癥反應綜合征，是CAR-T回輸后最常見的不良反應，也被認為是CAR-T療法在體內(nèi)“發(fā)揮作用”的標志，但嚴重的CRS可導致患者死亡。大多數(shù)患者出現(xiàn)的輕度CRS可通過標準輔助治療，如類固醇、白細胞介素-6受體拮抗劑妥珠單抗來控制[33-34]。CAR-T回輸前的預處理化學治療能降低患者的腫瘤負荷，也能在一定程度上降低CRS反應[34-35]。

4.1.2神經(jīng)毒性CAR-T回輸后的神經(jīng)毒性主要包括意識混亂、失語癥、反應遲鈍、肌陣攣、癲癇等，在大多數(shù)患者中是可逆的，但嚴重時可引起腦水腫，導致患者死亡。2017年3月，Juno公司因臨床試驗中出現(xiàn)多例腦水腫患者死亡而正式宣布放棄CAR-T產(chǎn)品JCAR015的Ⅱ期臨床試驗。但目前在河南中醫(yī)藥大學血液科參與CAR-T臨床試驗的近70例患者中，尚未觀察到明顯的神經(jīng)系統(tǒng)毒性。

鑒于CAR-T不良反應的不可預知性，已有研究嘗試在CAR-T中加入“自殺基因”或“分子開關”來實現(xiàn)細胞的可控凋亡。2018年第54屆美國臨床腫瘤學會年會中，上海恒潤達生生物科技有限公司(自2015年起與河南中醫(yī)藥大學血液科合作開展CAR-T療法臨床試驗研究)受邀匯報2項最新臨床項目進展，其中之一就是帶有安全開關的以BCMA為靶點治療MM的CAR-T。該公司開發(fā)的是通過γ-反轉(zhuǎn)錄病毒介導的活化T細胞轉(zhuǎn)導，以表達具有4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的第2代CAR，以及截短的表皮生長因子受體作為安全開關的抗BCMA-CAR-T產(chǎn)品。

4.1.3脫靶效應理想狀態(tài)下的靶點抗原是僅表達于腫瘤細胞，而正常細胞及CD34+細胞不表達。但實際上很多CAR-T的靶點在正常組織細胞上也有表達，這就導致正常細胞也會受到CAR-T的攻擊而受損傷。為了提高CAR-T的特異性，除了尋找更理想、特異性更高的靶點外，科學家們也在不斷進行新的嘗試。如不斷改進CAR-T的結(jié)構(gòu)以提高其作用的精準性和安全性。改進CAR-T結(jié)構(gòu)的方法主要有以下幾種:(1)串聯(lián)型CAR-T。例如CD19和CD22，制備2個CAR用1個T細胞來表達。但CD19和CD22的串聯(lián)順序會影響CAR-T的殺傷能力，其療效反而不如CD19-CAR-T[36]。(2)抑制性CAR-T(inhibitory CAR,iCAR)?？墒褂米R別腫瘤相關抗原的胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)建CAR，使用識別正常細胞抗原的胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)建iCAR，以降低脫靶效應。(3)組合抗原。WILKIE等[37]將2個識別不同抗原的CAR表達于細胞表面，每個CAR結(jié)構(gòu)都是不完整的，只有當2個抗原同時被識別后才能激活細胞內(nèi)啟動原件。

4.1.4B細胞再生障礙ALI等[32]研究發(fā)現(xiàn)了1例MM患者在輸注CAR-T后出現(xiàn)正常漿細胞缺乏。該研究表明，在某些情況下，免疫球蛋白替代療法(如輸注丙種球蛋白)應該用于接受抗BCMA-CAR-T治療的患者。

4.2CAR-T治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤后復發(fā)的應對策略

4.2.1增強CAR-T殺傷力，避免免疫逃逸研究人員研制出一種新型CAR-T，能同時表達促炎性因子及細胞因子受體，使CAR-T細胞既能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制信號，又能通過細胞因子受體的激活而促進CAR-T增殖，這種類型的CAR-T也稱為“裝甲車”。2018年8月，紀念斯隆凱特琳癌癥中心的科學家LIU等[38]將CAR-T和免疫檢查點抑制劑這2種最具潛力的免疫療法結(jié)合在一起，研究出了一種新型CAR-T，其能夠有效對抗實體腫瘤。這種CAR-T能分泌一種迷你版本的免疫檢查點阻斷抗體，該抗體可發(fā)揮類似程序性細胞死亡受體-1(programmed cell death 1，PD-1)抗體藥物的作用。這種構(gòu)想也可以應用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。

除了直接讓CAR-T分泌免疫檢查點阻斷抗體，還可以將CAR-T治療與口服免疫檢查點抑制劑聯(lián)合起來。免疫檢查點是指免疫系統(tǒng)中存在的一些抑制性信號通路。正常情況下，免疫檢查點的調(diào)節(jié)功能可使機體免受自身免疫攻擊及炎癥損害。細胞惡變后可通過上調(diào)免疫檢查點的表達，抑制T細胞的殺傷功能，從而逃脫免疫監(jiān)視。免疫檢查點療法是通過阻斷被癌細胞激活的免疫抑制通路，從而提高T細胞抗腫瘤的免疫應答。近年來，免疫檢查點抑制劑迅速發(fā)展，其中最有名的是2018年在中國上市的PD-1抑制劑納武利尤單抗和帕博利珠單抗。CHONG等[39]報道了1例難治性DLBCL患者經(jīng)CD19-CAR-T治療無效后加用帕博利珠單抗進行治療，該患者療效評價為疾病緩解(response disease，RD)，并觀察到加用帕博利珠單抗后CD19-CAR-T的增殖活性得到了大幅度提高。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過反復多次化學治療后T細胞的活性下降，尋找標志物來篩選出活性較強的T細胞有可能會提高CAR-T的殺傷力[40-41]。

4.2.2克服高危基因突變在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中存在遺傳學或分子生物學方面的不良預后因素，有些具有相對特異性，比如t(4；14)對于MM是不良預后因素，但對于白血病并非如此；有些具有共性，比如TP53基因突變和復雜染色體核型在任何一種腫瘤中都是不良預后因素。臨床中一些藥物也是通過干預基因突變或融合基因達到控制甚至治愈疾病的目的。95%的慢性粒細胞白血病患者存在Ph染色體陽性，Ph染色體指22號染色體長臂與9號染色體發(fā)生易位形成的新染色體，即t(9；22)(q34；q11)。酪氨酸激酶抑制劑的問世使慢性髓樣白血病和ALL患者10 a總體生存率達80%以上[42-44]。經(jīng)聚合酶鏈反應檢測發(fā)現(xiàn)，使用該藥治療的慢性粒細胞白血病患者的骨髓或外周血中融合基因多數(shù)可達到完全分子學緩解。治療MM的新藥硼替佐米和來那度胺可以克服t(4；14)帶來的不良預后，使患者獲益。從這些獲得確切效果的藥物中，或許能得到一些啟發(fā)：能否研制一些新型藥物來糾正染色體或基因突變，以此來預防疾病復發(fā)、改善腫瘤類疾病的不良預后？

4.2.3中醫(yī)藥預防CAR-T回輸后的復發(fā)中醫(yī)學認為，腫瘤的發(fā)生與體內(nèi)邪氣熾盛產(chǎn)生“邪毒”以及正氣虛弱無力抗邪有關，正如《內(nèi)經(jīng)·素問》中所說：“邪之所湊，其氣必虛”。中醫(yī)對于腫瘤多采取攻邪、扶正或攻補兼施的治療方法。扶正即通過補氣、養(yǎng)血、溫陽、滋陰等方法提高人體的抗邪能力，預防疾病發(fā)生或促進疾病痊愈。對于CAR-T治療后的腫瘤復發(fā)，中醫(yī)可著眼于提高T細胞活力、延長T細胞在體內(nèi)的存續(xù)時間。目前，尚未見相關的臨床研究報道，其臨床療效及具體作用機制有待進一步研究。

除此之外，CAR-T療法也可作為難治復發(fā)性ALL造血干細胞移植前的橋接治療。對于反復進行化學治療不緩解的患者，CAR-T回輸后能很快獲得CR(骨髓象及MRD均轉(zhuǎn)為陰性)，從而為造血干細胞移植創(chuàng)造機會。CAR-T回輸后的鞏固維持治療是給予小劑量化學治療還是其他療法，目前尚有待繼續(xù)研究。

CAR-T療法在血液系統(tǒng)腫瘤取得的療效讓人振奮，但仍有很多問題需要解決。CAR-T療法是否有一些遠期的不良反應？患者在接受CAR-T治療達到CR(或MM達到PR以上療效)后是否有必要繼續(xù)化學治療或口服新藥鞏固治療？這些問題都需要通過長期臨床觀察來驗證。