崔中鋒，張 瑩，姜 瑜

臨床流行病學 統(tǒng)計顯示，作為全球第五大惡性腫瘤和常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤， 原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）在我國的發(fā)病率不斷升高，其惡性程度高，預后差，致殘率、病死率高。 目前， 關(guān)于PLC 的分子機制研究尚有待完善。p28GANK 為含有226 個氨基酸的蛋白 （分子量為25kDa）， 在 臨 床 上 又 將 其 稱 為P28GANK 或PSMD10。 p28GANK 最初由日本學者Fujita 等在人肝癌細胞中通過cDNA 文庫經(jīng)消減雜交法克隆得到，并被認為是一個肝癌差異表達基因，能夠介導蛋白質(zhì)之間的相互作用，發(fā)揮多種生物學功能［2］。隨后有 文獻［3-5］逐漸證實，p28GANK 蛋白的表 達水平與PLC、食管癌、胰腺導管癌等患者的病理特征及預后相關(guān)，但該基因促進PLC 發(fā)生、發(fā)展的作用機制目前尚未完全闡述清楚。 為此， 該文重點分析p28GANK 蛋白表達情況與PLC 發(fā)病相關(guān)性及其可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 病例資料 收集2015 年3 月—2018 年3 月筆者所在醫(yī)院腫瘤科行手術(shù)切除治療并經(jīng)病理證實的48 例PLC 患者的蠟塊組織標本，其中有28 例患者術(shù)中取得癌旁組織（選取標準為距離腫瘤包膜≥5 cm）。 所有標本經(jīng)10%甲醛溶液固定及石蠟包埋，切片厚4 μm。 病例納入標準：（1）符合衛(wèi)生部頒布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》（2011 年）［6］中相關(guān)診斷標準；（2） 肝功能按照Child 分級分為 A、B、C 級；（3）術(shù)前未經(jīng)任何放化療或介入治療；（4）入選患者或其家屬均對該研究的目的和意義知情，并簽署知情同意書。 排除標準：（1）診斷為各種繼發(fā)性肝癌及門靜脈主干癌栓阻塞；（2）骨髓、腎和心臟功能嚴重受損或不全；（3）合并其他腫瘤疾病、嚴重感染、內(nèi)分泌疾病、免疫疾病、精神或神經(jīng)系統(tǒng)疾??；（4）臨床病歷與隨訪資料不全。 48 例PLC 患者中， 男27例，女21 例；年齡42～76 歲，平均（57．28±10．10）歲；最大腫瘤直徑＜5 cm 者27 例，≥5 cm 者21 例。 按照美國腫瘤聯(lián)合會（American Association of Cancer，AJCC）［7］制定的肝細胞肝癌分期：Ⅰ～Ⅱ期29 例、Ⅲ～Ⅳ期19 例，肝功能分級：A 級16 例、B 級22 例、C級10 例，伴淋巴結(jié)和（或）遠處轉(zhuǎn)移者19 例。 該研究符合該院倫理委員會及衛(wèi)生部《涉及人的生物醫(yī)學研究倫理審查辦法》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 免疫組織化學法 均采用免疫組織化學S-P法染色法，獲取的組織切片常規(guī)脫蠟、水化處理后，置入3%過氧化氫溶液中并于室溫下孵育30 min 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常非免疫羊血清（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）置于室溫封閉30 min，滴加兔抗人p28GANK 單克隆抗體 （Santa Cruz 公司），濃度為1∶50，于密封濕盒中4 ℃過夜，滴加生物素標記二抗（即用型）與標記過氧化物酶的鏈霉菌抗生物素蛋白 （福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），應(yīng)用DAB 顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），蘇木素（Sigma 公司）復染及中性樹膠封片。

1.3 p28GANK 蛋白表達評判標準 結(jié)果評估參照文獻［8］的方法，以已知陽性的結(jié)腸腺癌切片做陽性對照， 陰性對照以磷酸緩沖鹽溶液代替一抗，由該院兩位醫(yī)師在不明確患者臨床病理資料的情況下進行顯微鏡下觀察，p28GANK 免疫組織化學染色陽性物質(zhì)定位于細胞質(zhì)和（或）細胞核。 每例患者的組織標本隨機觀察3 個視野（×200），以陽性細胞比例與染色強度判定染色結(jié)果。 無陽性細胞、陽性細胞＜30%、陽性細胞30%～60%、陽性細胞＞60%分別記0、1、2、3 分；無染色、弱陽性染色、陽性染色、強陽性染色分別記0、1、2、3 分；兩項評分分值之和0～2 分為p28GANK 表達陰性、3～6 分為陽性。

1.4 凋亡基因表達檢測 同樣采用以上方法（免疫組織化學S-P 法染色法）評估每例患者組織標本中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax 的蛋白質(zhì)表達水平，其中即用型Bcl-2 鼠抗人單克隆抗體、Bax 鼠抗人單克隆抗體均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，結(jié)果同樣以陽性細胞比例與染色強度判定染色結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學方法 選用統(tǒng)計學軟件SPSS19．0 分析和處理研究數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用%表示，不同病理組織p28GANK 蛋白表達陽性率及Bcl-2、Bax 蛋白表達陽性率對比采用χ2檢驗；p28GANK 蛋白表達與Bcl-2、Bax 蛋白表達的相關(guān)性采用Spearman 等級相關(guān)系數(shù)進行評價；PLC 組織p28GANK 蛋白與臨床病理特征關(guān)系均采用χ2檢驗； 以P＜0．05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 p28GANK 蛋白及凋亡相關(guān)基因表達情況 組織中p28GANK 蛋白陽性表達多表現(xiàn)為棕黃色細小顆粒，定位于細胞核和細胞質(zhì)；Bcl-2、Bax 蛋白的陽性產(chǎn)物亦為棕黃色顆粒，定位于細胞質(zhì)中；見圖1。PLC 組織中p28GANK 蛋白及Bcl-2、Bax 蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁組織（P＜0．05），見表1。

2.2 p28GANK 蛋白表達與Bcl-2、Bax 蛋白表達的相關(guān)性 PLC 組織中p28GANK 蛋白表達陽性的36 例患者中29 例Bcl-2 蛋白表達陽性，而僅24 例Bax 蛋白表達陽性，Spearman 等級相關(guān)分析顯示，PLC 組織中p28GANK 蛋白與Bcl-2 蛋白陽性表達存在相關(guān)性，且差異具有顯著性（r=0．353，P＜0．05），而與Bax 蛋白陽性表達的相關(guān)性不具有顯著性（r=0．095，P＞0．05），χ2值比較見表2。

2.3 p28GANK 蛋白表達與病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、最大腫瘤直徑、肝功能分級的PLC 患者組織p28GANK 蛋白陽性表達率無顯著性差異（P＞0．05），但Ⅲ～Ⅳ期患者組織p28GANK 蛋白陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期患者， 有淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移的患者組織p28GANK 蛋白陽性表達率高于無淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移的患者，且差異具有顯著性（P＜0．05），見表3。

圖1 PLC 組織、癌旁組織p28GANK 蛋白及Bcl-2、Bax 蛋白表達示例（×400）

表1 p28GANK 蛋白及凋亡相關(guān)基因表達情況［例（%）］

表2 p28GANK 蛋白表達與Bcl-2、Bax 蛋白表達的關(guān)系（例）

表3 p28GANK 蛋白表達與病理特征的關(guān)系

3 討 論

關(guān)于PLC 的發(fā)生、發(fā)展誘因尚為臨床研究的熱點問題， 目前已明確其與HBV、HCV、 黃曲霉毒素B1 等致癌因子引起的癌基因變化有關(guān)，例如N-ras基因、C-myc 基因、C-fos 基因的激活與p53 抑癌基因的失活等［9］。 由于p28GANK 是通過肝癌cDNA文庫消減雜交法獲得的相關(guān)基因，近年來對于其在肝癌中的研究逐漸受到關(guān)注。 Iwai 等［10］的早期肝細胞再生研究顯示，p28GANK 過表達發(fā)生于肝細胞再生的初期， 其表達相與細胞周期蛋白D1 上調(diào)及Rb 蛋白下降類似，提示p28GANK 有助于促進肝細胞再生。 分子機制報道［11］顯示，p28GANK 基因主要通過Rb、 鼠雙微基2 及p53 等信號途徑實現(xiàn)對細胞周期進程的調(diào)控、促進細胞的增殖及抑制細胞凋亡， 提示p28GANK 基因可能在細胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有極為重要的作用。 李世杰等［12］的結(jié)果顯示，PLC 患者經(jīng)動脈化療栓塞后殘余肝癌細胞中p28GANK 蛋白表達水平高。 該次研究結(jié)果顯示PLC 組織中p28GANK 蛋白及Bcl-2、Bax 蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁組織， 提示p28GANK 蛋白表達與PLC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

相關(guān)學者認為，p28GANK 促進腫瘤惡性進展的可能機制體現(xiàn)在： 三維晶體結(jié)構(gòu)p28GANK 分子表面有凹槽，可與其他分子相互作用，繼而實現(xiàn)多種復雜的生物學功能， 如Rb 蛋白能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、凋亡等惡性生物學行為，p28GANK 上具備與Rb 相互作用位點， 可通過26S 蛋白酶體的S6b腺苷三磷酸酶來降解Rb， 或者直接與26S 蛋白酶體20S 核心結(jié)合介導其自我降解；p53 通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要的角色，而p28GANK 可與MDM2N-端RING 結(jié)構(gòu)域結(jié)合激活后者引起構(gòu)象變化，繼而促使p53 泛素化及降解，間接促進細胞增殖與抑制細胞凋亡［13，14］。該研究Spearman 等級相關(guān)分析顯示，PLC 組織中p28GANK 蛋白與Bcl-2 蛋白陽性表達存在明顯的相關(guān)性（r=0．353），而與Bax蛋白陽性表達不相關(guān) （r=0．095），Bcl-2 和Bax 一對凋亡因子，前者可抑制凋亡，而后者主要促進凋亡，二者通常用于反映腫瘤細胞的生長狀態(tài)，尤其是作為人類濾泡性淋巴斷裂點發(fā)現(xiàn)的癌基因，凋亡抑制因子Bcl-2 蛋白的過度表達可起到抑制腫瘤細胞凋亡的作用［15］。 該研究結(jié)果表明高p28GANK 蛋白表達可能通過上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2 的表達而影響腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移， 推斷可能機制為p28GANK與Bcl-2 均可通過作用于細胞凋亡的不同階段而發(fā)揮協(xié)同抗凋亡效應(yīng)， 從而促進PLC 的發(fā)生與發(fā)展； 而p28GANK 與Bax 可能通過不同途徑作用于凋亡過程，因而二者陽性表達不具有相關(guān)性。

此外，莫瑞祥等［16］的報道認為p28GANK 蛋白過表達與PLC 的多項病理參數(shù)具有密切關(guān)系，本研究統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、最大腫瘤直徑、肝功能分級的PLC 患者組織中p28GANK 蛋白陽性表達率無明顯差異， 但Ⅲ～Ⅳ期患者組織p28GANK 蛋白陽性表達率明顯高于I～Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移患者組織p28GANK 蛋白陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移的患者，進一步證實p28GANK 蛋白過表達可促進PLC 的惡性進展，尤其是腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移，可能與高p28GANK蛋白表達影響凋亡抑制基因Bcl-2 的表達有關(guān)，但p28GANK 與Bcl-2 的相互作用仍有待進一步闡明。