黃盛，李瓏，王志福，楊敏光，李建鴻，張嘉泳，陳立典

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市350122；2.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州市350122；3.福建康復(fù)產(chǎn)業(yè)研究院技術(shù)創(chuàng)新平臺(tái)，福建福州市350122；4.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復(fù)研究中心，福建福州市350122

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種年齡相關(guān)，以學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能進(jìn)行性下降為特點(diǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]；病理學(xué)特征為老年斑形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元及突觸丟失。其中β 淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)的異常積累可以觸發(fā)神經(jīng)纖維纏結(jié)形成和老年斑塊沉積和神經(jīng)元退行性變，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙。β 位淀粉樣前體蛋白裂解酶1 (β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1, BACE1)是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)裂解為Aβ 的限速酶和關(guān)鍵酶[2-3]。針刺人體特定穴位，可以產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)AD 等多種神經(jīng)退行性疾病均可有效的延緩學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能損傷[4-5]。

我們前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)[6-7]，電針百會(huì)可改善APP/PS1小鼠大腦葡萄糖代謝，增強(qiáng)腦區(qū)神經(jīng)元增殖、分化和突觸聯(lián)系，從而緩解學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙，本研究觀察電針百會(huì)、神庭對(duì)APP/PS1 小鼠大腦BACE1表達(dá)及Aβ沉積的影響，進(jìn)一步探討電針改善AD學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因型小鼠24只，體質(zhì)量(35±2) g，相同背景、月齡野生型小鼠8 只，均購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)SYXK(閩)2014-001。APP/PS1 小鼠編號(hào)1～24，以隨機(jī)數(shù)字表任一數(shù)字為起始編號(hào)，以抽取的數(shù)字除以3，所得余數(shù)為0、1、2，相應(yīng)分到模型組、電針組、非穴組，各8 只；8 只野生型小鼠為野生組。實(shí)驗(yàn)過程中，飼養(yǎng)、干預(yù)、犧牲等均嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利與倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器

Aβ 和BACE1 抗體：美國ABCAM 公司。DAB 免疫組化試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。華佗牌SDZ-Ⅴ電針治療儀、0.5 寸銅柄毫針。RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國Ⅴazym 公司。BACE1及GADPH 引物：上海生工生物有限公司。Morris 水迷宮：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

1.3 方法

電針組以30 號(hào)毫針斜行刺入百會(huì)、神庭[8]，深約0.5 mm，針柄連接電針儀，百會(huì)接正極，神庭接負(fù)極。取電壓2 Ⅴ，疏密波，頻率1 Hz 和20 Hz。每次30 min，每天1次，共28 d。

非穴組取雙側(cè)脅下非經(jīng)非穴點(diǎn)，左側(cè)接正極，右側(cè)接負(fù)極，參數(shù)與電針組相同。野生組和模型組予同等時(shí)間和程度的抓取、固定，不予特殊處理。

1.4 Morris水迷宮

水迷宮水池呈圓筒狀，池壁上4 個(gè)等距離點(diǎn)分水池為4 個(gè)象限，平臺(tái)直徑6 cm，放置于第三象限，沒于水面下2 cm，水溫(22±2)℃。攝像系統(tǒng)懸于水迷宮圓心正上方。

1.4.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

將小鼠按順時(shí)針方向順序從4 個(gè)象限面向池壁放入水中。如果小鼠在90 s 內(nèi)找到平臺(tái)并停留3 s 以上，記此為逃避潛伏期。如果小鼠90 s 內(nèi)未能找到平臺(tái)，將其引導(dǎo)到平臺(tái)，熟悉15 s，逃避潛伏期記為90 s。共4 d。

1.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

定位航行實(shí)驗(yàn)后第2 天撤去平臺(tái)，小鼠從第一象限放入水中，以原平臺(tái)所處位置為優(yōu)先記錄區(qū)域。記錄90 s內(nèi)小鼠穿過該區(qū)域的次數(shù)。

1.5 取材

干預(yù)及行為學(xué)測試結(jié)束后，每組取5只小鼠，4%異氟烷1 L/min 吸入麻醉，2 min 后夾捏小鼠皮膚，確認(rèn)成功麻醉。左心室灌注生理鹽水約50 ml，4%多聚甲醛繼續(xù)灌注。迅速斷頭處死，剝離腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，石蠟切片機(jī)冠狀切片，厚5 μm。

各組其余3 只同法麻醉，快速取腦，生理鹽水洗凈，-80 ℃凍存。

1.6 Aβ測定

石蠟切片常規(guī)脫蠟，枸櫞酸緩沖液熱修復(fù)抗原10 min，冷卻至室溫；PBS 漂洗3 次，每次5 min；山羊血清封閉液封閉40 min，加Aβ 一抗(1∶1000) 4 ℃過夜；PBS漂洗；加抗鼠488二抗(1∶1000)37 ℃孵育1 h，PBS 漂洗；DAPI 封片劑封片。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。以大腦皮質(zhì)為圖像分析區(qū)域，每組取6 個(gè)視野，用Nikon 顯微鏡和Image J 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和處理，測有效陽性面積。

1.7 BACE1測定

石蠟切片常規(guī)脫蠟，枸櫞酸緩沖液熱修復(fù)抗原10 min，冷卻至室溫；PBS 漂洗3 次，每次5 min；3% H2O2室溫孵育10 min，PBS 漂洗；10%羊血清37 ℃孵育10 min；加BACE1 一抗(1∶300) 4 ℃過夜；PBS 漂洗；加生物素化二抗37 ℃孵育10 min，PBS 漂洗；DAB 顯色，清水漂洗，蘇木素染色30 s。脫水，封片。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。以大腦皮質(zhì)為圖像分析區(qū)域，每組取6 個(gè)視野，用Nikon 顯微鏡和Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和處理，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 BACE1 mRNA測定

取小鼠凍存腦組織200 mg，加裂解液1 ml充分研磨震蕩；加氯仿200 μl，震蕩混勻，4 ℃靜置10 min；4 ℃、12,000 g 離心15 min；取無色上層溶液500 μl，加預(yù)冷異丙醇溶液500 μl，混勻，4 ℃靜置20 min；4 ℃、12,000 g離心15 min，棄上清，白色沉淀加75%乙醇，輕輕吹打，反復(fù)洗滌管壁，懸浮沉淀，靜置5 min；4 ℃、12,000 g 離心5 min，棄上清，干燥沉淀，加入DEPC 水20 μl充分溶解，核酸紫外分光光度計(jì)測定OD值。取RNA 1 μl加反應(yīng)體系20 μl，合成cDNA。取cDNA 稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品2 μl，加反應(yīng)體系20 μl 擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，變性、退火、延伸共30 個(gè)循環(huán)，最后70 ℃延伸5 min。

BACE1 引物序列：上游5'-CCG GCG GGA GTG GTA TTA TGA AGT-3'；下游5'-GAT GGT GAT GCG GAA GGA CTG ATT-3'。

GAPDH 引物序列：上游5'-TGG AAA GCT GTG GCG TGA T-3'；下游5'-TGC TTC ACC ACC TTC TTG AT-3'。

應(yīng)用ABI Fast-7500 Real time PCR 儀測目的基因Ct值，計(jì)算ΔΔCt。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以(xˉ±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

模型組較野生組逃避潛伏期時(shí)間顯著延長(P ＜0.001)。與模型組小鼠相比，電針組逃避潛伏期顯著縮短(P ＜0.001)，非穴組與模型組間無顯著性差異(P ＞0.05)。見表1。

水迷宮軌跡圖顯示，野生組可以迅速判斷平臺(tái)所在位置，并迅速找到平臺(tái)，軌跡清晰，目標(biāo)明確；電針組與野生組軌跡圖相近；模型組和非穴組軌跡紊亂，較難找到平臺(tái)所在位置。見圖1。

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組穿越平臺(tái)次數(shù)較野生組顯著減少(P ＜0.001)。與模型組相比，電針組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P ＜0.001)。見表1。

2.2 Aβ測定

野生組未見明顯Aβ 沉積。與模型組和非穴組相比，電針組Aβ 水平顯著減少(P ＜0.001)。見圖2、表2。

2.3 BACE1水平

模型組BACE1 水平顯著高于野生組(P ＜0.001)。與模型組和非穴組相比，電針組BACE1 水平顯著降低(P ＜0.001)。見圖3、表3。電針組BACE1 mRNA水平也顯著降低(P ＜0.001)。見表4。

表1 各組Morris水迷宮結(jié)果比較

圖1 各組小鼠水迷宮定位航行軌跡圖

圖2 各組大腦皮質(zhì)Aβ沉積(免疫熒光染色，200×)

表2 各組Aβ陽性面積比較(IOD)

表3 各組BACE1陽性細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

Aβ 的沉積啟動(dòng)病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)；Aβ 蛋白寡聚化后形成淀粉樣沉淀，導(dǎo)致突觸功能障礙，神經(jīng)元丟失，引起認(rèn)知功能障礙[9-10]。減少或清除Aβ 可能是預(yù)防和治療AD 的重要策略。AD 屬于中醫(yī)“呆病”，病位在腦。腦為元神之府，司視聽、思維、記憶等認(rèn)知相關(guān)功能；陽氣充盈上行并填充髓海，是保持認(rèn)知功能的重要基礎(chǔ)。督脈循行于背部正中，與六陽經(jīng)均有交匯；督脈通暢保證陽氣充盈入腦，濡養(yǎng)髓海，可以保持或提升認(rèn)知水平。百會(huì)為督脈要穴，為各經(jīng)脈氣會(huì)聚之處，有升陽舉陷，益氣固脫功效；神庭為督脈、足太陽和足陽明經(jīng)之會(huì)，有寧神、開竅等功效。聯(lián)合針刺百會(huì)、神庭兩穴有益氣升陽、填髓充腦、醒腦開竅之功效，達(dá)到改善認(rèn)知功能的作用[11]。實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)[12-13]，電針或針刺可以改善AD小鼠的認(rèn)知障礙。

APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠可以模擬AD 的病理過程，且表現(xiàn)出時(shí)間依賴性Aβ 沉積增多等病理特征，以及學(xué)習(xí)記憶能力緩慢下降等特點(diǎn)，是一種廣泛應(yīng)用于AD 基礎(chǔ)研究的動(dòng)物模型[14]。該動(dòng)物模型將人21、14號(hào)染色體上的APP 及PS1 突變基因轉(zhuǎn)入小鼠，加速Aβ 在腦內(nèi)的產(chǎn)生，使APP/PS1 小鼠早期即出現(xiàn)可被檢測的空間學(xué)習(xí)記憶能力減退。大部分實(shí)驗(yàn)研究表明[15-16]，4～5 月齡APP/PS1 小鼠表現(xiàn)出輕微行為學(xué)異常；而隨著年齡增長，空間學(xué)習(xí)記憶能力下降越趨明顯，6～8月齡海馬區(qū)開始出現(xiàn)老年斑和Aβ沉積。因此本研究選取8月齡APP/PS1小鼠作為干預(yù)對(duì)象。

本研究顯示，9 月齡APP/PS1 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，大腦皮質(zhì)BACE1 表達(dá)增多，出現(xiàn)顯著Aβ斑塊沉積；電針百會(huì)、神庭可以影響B(tài)ACE1 的表達(dá)，減少Aβ，減輕學(xué)習(xí)記憶損傷。與先前的研究相似[17-18]。

圖3 各組大腦皮質(zhì)BACE-1表達(dá)(免疫組化染色，400×)

表4 各組BACE1 mRNA表達(dá)比較

Aβ是由1型跨膜蛋白APP水解而來，水解過程由BACE1 啟動(dòng)。BACE1 與Aβ 的產(chǎn)生顯著相關(guān)[19]。敲除BACE1的小鼠，Aβ沉積明顯減少甚至無Aβ沉積[20-21]。通過siRNA 靶向BACE1 可減少APP 轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ 產(chǎn)生，延緩神經(jīng)退行性變，改善行為缺陷[22]。電針大椎、腎俞也可以抑制BACE1 表達(dá)，從而改善SAMP8小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[23]。傳統(tǒng)中藥治療APPⅤ717小鼠同樣發(fā)現(xiàn)降低BACE1表達(dá)水平，減少AD 模型小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積[24]。抑制BACE1 的表達(dá)還能有效減輕突觸損傷、內(nèi)體功能障礙和溶酶體-自噬系統(tǒng)損傷[25-26]。

BACE1 對(duì)AD 的影響機(jī)制復(fù)雜。本研究顯示，電針可通過影響B(tài)ACE1 的表達(dá)，減少Aβ 產(chǎn)生。電針是否可以通過影響B(tài)ACE1 的表達(dá)從而對(duì)突觸損傷、內(nèi)體功能障礙等產(chǎn)生影響，還有待進(jìn)一步研究。