芮海云, 劉清泉, 沈振國

(1. 泰州學院 醫(yī)藥與化學化工學院, 泰州 225300； 2. 江蘇省中國科學院植物研究所 觀賞植物研究中心， 南京 210024； 3. 南京農業(yè)大學 生命科學學院， 南京 210095)

農業(yè)土壤的重金屬污染已成為嚴重的環(huán)境問題，不僅直接影響植物的生長發(fā)育、農產品的品質，還通過食物鏈危及人類的健康。因此，重金屬對農業(yè)土壤的污染及其在土壤-植物系統(tǒng)中的遷移成為當今普遍關注的全球環(huán)境問題，植物重金屬耐性的機理也逐漸成為研究的熱點之一。植物在長期進化過程中，形成了一系列對重金屬毒害的適應性機制，主要包括排斥和積累兩個機制。在排斥機制中，植物限制根系對重金屬離子的吸收和從根系向地上部的運輸，或主動向細胞外運輸有毒離子，在這方面根質外體、根系分泌物和菌根可能起著重要作用；而在積累機制中，植物把重金屬分布在特定的器官、組織或細胞器，以低生物活性的解毒形態(tài)存在。

近年來的研究表明，質外體不僅是一個結構性的被動防御屏障，更是一個動態(tài)性的主動防御體系，在植物抵抗重金屬脅迫中具有重要作用。質外體由細胞壁、細胞間隙、胞間層和導管的空腔組成，其中的液體被稱為質外體汁液。細胞壁包括初生壁和次生壁，相鄰細胞初生壁間有胞間層。初生壁主要由蛋白質和多糖(包括纖維素、半纖維素和果膠)組成，次生壁除同樣含纖維素和半纖維素外，大部分為木質素。蛋白質約占質外體所有成分的5%～10%。質外體汁液中的蛋白質與細胞壁幾乎沒有相互作用，在質外體空間自由移動。細胞壁中的蛋白質，一類通過范德華力、氫鍵、親水或離子鍵與細胞壁基質松散結合；另一類是細胞壁結構蛋白，通過共價鍵與細胞壁骨架結合，富含羥脯氨酸、脯氨酸和甘氨酸。由于早期人們對質外體蛋白質作用的忽視，加之其提取遠較胞內蛋白質困難，因此質外體蛋白質的研究落后于胞內蛋白質。近年來，隨著植物質外體蛋白質組學的發(fā)展, 越來越多的質外體蛋白質被鑒定出來, 為研究質外體蛋白質的功能奠定了良好的基礎。目前約500種擬南芥(Arabidopsisthaliana)質外體蛋白質已被鑒定；其次為水稻(Oryzasativa)，有314種質外體蛋白質被鑒定；關于鷹嘴豆(Cicerarietinum)、大豆(Glycinemax)、向日葵(Helianthusannuus)、煙草(Nicotianatabacum)、苜蓿(Medicagosativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)和玉米(Zeamays)等植物的質外體蛋白質分析也已見報道[2]。這些質外體蛋白質的功能主要有：1)參與多糖代謝，如糖苷水解酶和糖酯酶等；2)參與脅迫響應，如類萌發(fā)素蛋白、索馬甜蛋白和幾丁質酶等；3)參與蛋白質代謝，如蛋白酶、蛋白酶抑制劑等；4)參與氧化還原反應，如過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等；5)參與信號轉導，如蛋白激酶等[1-2]。

大量研究表明，作為金屬離子跨膜進入細胞質的第一道屏障，植物細胞壁對于重金屬離子進入細胞起很好的屏障作用。植物細胞通過影響細胞壁中多糖、蛋白質和木質素等成分的生物合成，可以改變其結合重金屬離子的能力，或改變重金屬的運輸與分配以及植物的生長發(fā)育，從而影響植物對重金屬的耐性[3]。質外體蛋白質參與植物細胞壁的重構[4]，在植物對重金屬的耐性中發(fā)揮重要作用。本文主要介紹質外體蛋白質在植物抗重金屬脅迫方面的研究進展。

1 細胞壁結構蛋白在植物重金屬耐性中的作用

植物細胞壁中主要的結構蛋白包括富含脯氨酸的蛋白 (PRPs)、富含甘氨酸的蛋白 (GRPs)和富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)家族。HRGP家族主要包括伸展蛋白、富含脯氨酸/羥脯氨酸糖蛋白、茄科凝集素和阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)。細胞壁結構蛋白通過共價鍵與細胞壁多糖交聯，這一交聯是一個動態(tài)變化的過程，可以影響細胞壁的強度和抗降解能力，在植物生長發(fā)育和對生物、非生物脅迫的響應過程中發(fā)揮重要作用[5]，同時植物細胞壁結構蛋白的結構和含量也可以影響其結合重金屬離子的能力。Pan等[6]研究發(fā)現，鋁能顯著誘導水稻根尖細胞壁HRGP含量升高，減輕鋁的毒害，且鋁耐性品種較鋁敏感品種顯著。Chandran 等[7]報道鋁脅迫能誘導蒺藜苜蓿AGP基因的表達，鋁敏感品種較鋁耐性品種顯著。細胞壁擴展蛋白調節(jié)細胞壁的松弛和伸展，Pena等[8]研究發(fā)現銅脅迫下小麥主根細胞壁擴展蛋白基因上調表達。在鉛脅迫下，大蒜根細胞壁富含半胱氨酸蛋白含量增加，和Pb2+相互作用，將Pb2+固定在根細胞壁中[9]。

2 質外體多糖代謝蛋白在植物重金屬耐性中的作用

參與多糖代謝的蛋白質是主要的質外體蛋白質，其中糖苷水解酶(GHs)和糖酯酶(CEs)在生物和非生物脅迫下變化顯著，說明細胞壁發(fā)生的改變主要是多糖的斷裂和修飾[5]。

質外體多糖代謝包括多糖的轉糖苷基、交聯、水解、轉乙?；⒀趸鸵阴；萚1]。木葡聚糖是雙子葉植物初生細胞壁中最主要的半纖維素，木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶(XTH)屬于GH家族，是一類催化木葡聚糖分子轉移或水解的酶，它能夠內切木葡聚糖聚合體，將產生的還原性末端連接到另外一個木葡聚糖鏈或水分子上，使連接纖維素微纖絲間的木葡聚糖鏈解聚，細胞壁膨脹疏松，促進細胞的生長。Zhu等[10]研究發(fā)現, 擬南芥XTH基因T-DNA插入突變體XTH31，根系細胞壁中木葡聚糖含量減少，降低了對鋁的結合力，因此對鋁的耐性高于野生型。 Yang等[11]研究發(fā)現，鋁處理能顯著抑制擬南芥根尖細胞木葡聚糖內轉糖苷酶的活性，使木葡聚糖鏈解聚困難，細胞壁無法松弛，細胞伸長受到抑制。

作用于果膠的CEs也是在生物和非生物脅迫下變化顯著的質外體蛋白質。果膠主要由半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(RG-Ⅰ)和鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(RG-Ⅱ)構成，半乳糖醛酸聚糖是半乳糖醛酸通過Ca2+交聯的聚合體，RG-Ⅰ和RG-Ⅱ由半乳糖醛酸和鼠李糖構成的主鏈和各自特有的支鏈糖基構成。果膠甲酯酶(PME)負責細胞壁中果膠的脫甲基化，使果膠帶有更多的自由羧基，提高了其結合重金屬的能力。Paynel等[12]研究發(fā)現，鎘處理能誘導亞麻PME活性增加。東南景天鎘超積累生態(tài)型根中PME的活性低于非超積累生態(tài)型，根中有更多的甲基酯化的果膠, 因此根部較非超積累生態(tài)型駐留較少的鎘，更多的鎘轉運至地上部[13]。 此外，Chen等[14]報道，過表達MAN3基因導致擬南芥甘露聚糖酶活性升高，細胞壁中甘露糖含量增加，因此擬南芥的鎘積累和鎘耐性增加。

3 質外體氧化還原蛋白在植物重金屬耐性中的作用

質外體氧化還原蛋白調節(jié)質外體氧化還原狀態(tài)，影響細胞壁木質素和多糖的組成，影響植物對重金屬的耐性[15]。

許多研究結果顯示，重金屬誘導活性氧(ROS)在植物根系和葉片質外體中的積累，誘導酶和非酶抗氧化系統(tǒng)的響應。我們的研究結果顯示[16]，鎘誘導H2O2在植物根質外體中的積累，質外體H2O2的增加伴隨著質外體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-過氧化物酶(NADH-POD)活性的升高，推測NADH-POD是質外體H2O2的來源之一。Zhang等[17]報道鎘脅迫下箭舌豌豆葉質外體汁液中含有較高的抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性，根質外體汁液中含有較高的SOD活性。過表達SOD和APX的轉基因擬南芥中，H2O2的積累激活許多木質素合成基因和轉錄因子的上調表達[18]。

木質素合成反應是植物應對脅迫的典型防御反應。鎘脅迫導致各種植物木質素含量的增加，過量的銅也能導致植物組織中木質素的積累，Cheng 等[19]報道，銅能通過促進Bruguieragymnorrhiza和Rhizophorastylosa的木質化，抑制其生長，降低根的滲透性。我們的研究也發(fā)現，銅刺激水稻根系的木質化，抑制根的伸長[20]。有假說認為，木質素在根系內皮層細胞壁中的沉積可以抑制金屬元素進入木質部或從維管束向外的運輸，根系木質部的木質化可以抑制重金屬向地上部的轉運。木質素主要由酚類化合物p-香豆醇、松柏醇和芥子醇聚合而成，木質素單體在細胞質內合成后被運送至質外體，最后在依賴H2O2的POD和依賴O2的漆酶(LAC)的催化下，聚合成為高分子木質素。

參與木質素氧化聚合的主要是第III類POD，存在于質外體，包括可溶態(tài)POD(SPOD)和細胞壁離子結合態(tài)(IPOD)。已有實驗結果顯示，POD基因表達的下調會導致植物木質素含量的降低及組成的改變，POD基因swpa4的過表達增加植物酚和木質素的含量[21]。蛋白質組學分析顯示，豇豆在高濃度錳脅迫下, 葉片質外體可溶性蛋白的濃度升高，其中一些酸性POD豐度顯著增加[22]。POD還氧化阿魏酸多糖和結構蛋白，導致高度復雜的大分子的形成，因而增加細胞和植物的結構強度[23]。在銅處理的Lygodiumjaponicum(Thunb.) Sw.中，富含糖醛酸的果膠聚合物和其他的細胞壁組分高度結合，這一過程也是在POD的催化下完成的[24]。

植物LAC被認為和POD一起參與木質素單體聚合的過程。有研究發(fā)現，轉陸地棉漆酶基因LAC1的楊樹莖的木質素含量高于野生型[25]。Berthet 等[26]對擬南芥lac4和lac17雙基因敲除突變體的研究發(fā)現，雙突變體莖中木質素含量比野生型低40%，并且在持續(xù)光照條件下，雙突變體植株出現矮化現象。擬南芥漆酶LAC11也被證明參與木質素單體的聚合過程，研究發(fā)現LAC4、LAC11 和LAC17 3基因敲除突變體中木質素積累幾乎完全得到抑制，植株生長嚴重受阻[27]。在擬南芥漆酶基因lac17 突變體中表達甘蔗漆酶基因SofLAC，能夠恢復突變體植株木質素含量，使其達到野生型水平，表明SofLAC參與甘蔗的木質化過程[28]。歐洲大葉楊Ptr-miR397a 能夠通過調控漆酶基因的表達改變木質素的含量[29]。Bhuiyan 等[30]研究發(fā)現，在鎘處理下大豆根生長受到抑制，根木質素含量增加，并伴隨著POD和LAC活性的增加。我們通過漆酶基因(OsLAC10)過表達擬南芥株系的研究發(fā)現，漆酶促進木質素的合成，減少根系對銅的吸收，增強植株對銅的耐性[20,31]。

4 質外體脅迫響應蛋白在植物重金屬耐性中的作用

脅迫響應蛋白通過誘導植物的一般脅迫響應過程，影響植物對重金屬脅迫的耐性。植物脅迫響應蛋白中最豐富的是病程相關蛋白(PR)，包括幾丁質酶、1,3-葡糖苷酶、索馬甜蛋白和類萌發(fā)素蛋白等。幾丁質酶和1,3-葡糖苷酶都是糖苷水解酶，索馬甜蛋白能破壞細胞膜或水解細胞壁多糖的1,3-糖苷鍵。蛋白質組學研究顯示，75 μmol/L鋁處理3天，水稻葉中幾丁質酶豐度上調2.9倍[32]。豇豆在高濃度錳脅迫下, 葉質外體汁液中葡糖苷酶、幾丁質酶和類索馬甜蛋白的豐度增加[22]。鎘脅迫下，玉米(ZeamaysL.cv. Quintal)和大豆(GlycinemaxL. cv. Korada)細胞壁β-1,3-葡聚糖酶同工酶活性增加[33]。類萌發(fā)素蛋白(GLPs)是植物質外體中普遍存在的與小麥萌發(fā)素序列高度相似的可溶性糖蛋白，在植物不同生長生育階段及不同的生物與非生物脅迫條件下表現出不同的生物學功能，是一類極其重要的脅迫響應蛋白。已有研究結果顯示，GLPs主要以酶、受體和結構蛋白的形式參與多種生理生化過程，酶包括超氧物歧化酶(SOD)、草酸氧化酶(OXO)、多酚氧化酶(PPOs)和ADP葡萄糖焦磷酸酶、磷酸二酯酶[34]。草酸氧化酶催化草酸降解成H2O2和CO2，最近Sakamoto等[35]利用體外和體內實驗證實了杜鵑花RmGLP2具有草酸氧化酶(OXO)活性，轉RmGLP2煙草細胞草酸含量降低。SOD和OXO的共同作用是產生H2O2，因此GLPs在質外體的存在，可能參與質外體 H2O2的形成，進而通過細胞壁蛋白質和多糖的交聯起到強化細胞壁的作用。Rietz 等[36]報道BnGLP3和BnGLP12誘導參與的氧化迸發(fā)在油菜抗真菌病害中起了重要作用。向日葵HaGLP1在擬南芥中的表達促進ROS積累和提高植株抗真菌病的能力[37]。Banerjee 等[38]報道過表達OsGLP1的煙草超量積累H2O2，并引起細胞壁組分的交聯，加固細胞壁結構。Davidson等[39]報道水稻的12個GLPs均定位在細胞壁中，病原菌浸染時，細胞壁迅速發(fā)生交聯作用以保護水稻葉片免受傷害。蛋白質組學分析顯示GLP(草酸氧化酶活性)在鋁處理的番茄根中被抑制[40]，轉錄組學研究也發(fā)現重金屬脅迫下水稻根GLP基因差異表達[41]，顯示GLP在植物重金屬耐性中發(fā)揮作用。

5 小結與展望

近年來的研究表明，質外體蛋白質在植物重金屬耐性中具有重要作用，然而質外體蛋白質如何影響質外體氧化還原穩(wěn)態(tài)，參與質外體成分的組織和重建，從而影響植物對重金屬的耐性？其機理尚不清楚[42]。目前關于質外體蛋白質在植物重金屬耐性中作用的研究大多集中在生理生化水平，且是對少數質外體蛋白質的研究。隨著蛋白質組學、轉錄組學等技術的應用，可望在整體水平上對質外體蛋白質在植物重金屬耐性中作用的分子機制進行深入研究。可圍繞重金屬脅迫下植物質外體蛋白質的差異表達和修飾；質外體蛋白質相關基因的表達調控；質外體蛋白質表達變化與質外體氧化還原穩(wěn)態(tài)、質外體組成改變的關系等進行研究，以闡明質外體蛋白質在植物重金屬耐性中的作用及其分子機制。這不僅具有重要的理論意義，而且還可以通過分子遺傳學技術調控質外體組分的生物合成，改變重金屬在植物體內的積累和分配，特別是為降低重金屬在植物可食部分中的積累，保證農產品安全，提供新的技術途徑。